概述

        骨髓单个核细胞主要为单核细胞和巨噬细胞，在体外培养条件下可分化为成骨细胞，随着培养时间的延长，95%以上的贴壁生长细胞表现出成骨细胞的特征。在原代培养时培养液中加入高浓度马血清可限制骨髓中造血干细胞的生长，有利于单个核细胞的生长和分化。

用品

        (1)常规组织块法器皿，20mL注射器。

        (2)100U/mL肝素，含30%马血清的RPMI 1640培养液，含10%胎牛血清的MEM培养液。

步骤

        (1)用于人骨髓培养时，以健康人志愿者为对象，局麻下用含有5mL生理盐水和肝素(100U/mL)的20mL注射器从髂后棘抽取5~10mL骨髓。用于动物时，可取管状骨骨髓。

        (2)将骨髓标本移入FicoH梯度液中，离心，用吸管吸取单个核细胞部分，分散在含30%马血清的RPMI 1640培养液中，接种密度为3x10⁵/cm，在37℃含5%CO₂的湿化空气中培养。

        (3)培养5d时振荡培养瓶，吸除培养液，再加入培养液，振荡，吸除培养液，以便清除未贴壁生长的细胞。

        (4)对于贴壁生长的细胞，改用含10%胎牛血清的MEM培养液。

        (5)每周更换培养液1次，细胞长满时可用胰蛋白酶消化法收集细胞用于试验或进行传代培养。

操作提示

        (1)从新生动物或胚胎中切取的骨标本更容易获得成骨细胞。

        (2)骨组织块培养法多采用扁骨。

        (3)培养的成骨细胞中可能混杂有成纤维细胞，可通过差速贴壁分离法去除成纤维细胞。

结果及鉴定

        获得可传代培养的成骨细胞。鉴定指标如下。

        (1)形态观察:酶消化法和骨组织块法培养生长的成骨细胞多为立方状，体积小，核圆。骨髓培养法初期细胞为圆形，含单个核，两周后主要为梭形，细胞长满时近似方形。骨膜培养法获得的成骨细胞为长梭形，与纤维细胞非常相似。

        (2)碱性磷酸酶(AKP)活性检测:碱性磷酸酶活性是成骨细胞分化成熟的重要标志之一，可采用细胞化学染色定量测定，并以同源的其他细胞(多用纤维细胞)为对照。成骨细胞碱性磷酸酶染色阳性，或可测得一定数值，同源的其他细胞染色阴性。

        (3)骨玻璃样蛋白(boneglasspro-tein，BGP)检测:BGP是骨细胞的标志物之一，用¹²⁵1标记的兔抗牛BGP抗体，通过放射免疫法可测定细胞中BGP含量。如果在测定前两天给细胞培养液中加入二羟基维生素D3[1，25(OH)D3]10^-9mo/L,可明显增加成骨细胞中BGP的含量。如果用免疫组织化学染色法，BGP与抗体结合，被乙基咔唑染成棕色，多出现在细胞核周围。

        (4)I型和Ⅲ型原胶原测定:成熟的成骨细胞能合成I型胶原，不能合成亚型胶原，I型原胶原也是成骨细胞的标志物之一。免疫组织化学法染色I型原胶原阳性反应主要出现成骨细胞核周围，也可用放射免疫法进行定量检测。在成骨细胞培养中，有时可见个别I型原胶原阴性或Ⅲ型原胶原阳性的细胞，可能是因为培养中混杂少量未分化的间充质细胞。成骨细胞Ⅲ型原胶原检测为阴性。

        (5)矿化检测:成骨细胞在体外培养时能形成矿化的细胞外基质，一般培养至6~8周时即可出现。矿化区经Von Kossa染色呈阳性反应。电子探针微分析仪检测矿化区，矿化的主要成分为钙和磷，Ca/P值约为2，与羟基磷灰石结晶中Ca/P值相符。