01 实验前准备

 

        1、试剂准备：从4℃冰箱中取出培养细胞所需的培养基、胰酶、胎牛血清（FBS）、双抗（P/S）以及PBS缓冲液，放置于室温下，直至恢复常温。

        2、耗材准备：准备好50mL和15mL离心管，以及移液枪等实验耗材。

        3、实验条件准备：开启超净工作台，先开启紫外灯照射30分钟，接着通风3至5分钟后，即可开始实验操作。

02 实验步骤

 

 1、洁净要求：

        进入实验室后，穿戴好实验服、口罩和手套等装备，将试剂和耗材用酒精喷洗后放入超净台，手部也需用酒精喷洗，确保操作环境洁净，然后开始实验。

2、试剂分装及配制：

        （1）配制完全培养基：在50mL离心管中，加入5mL胎牛血清（FBS）和500μL双抗（P/S），然后加入基础培养基，定容至50mL，搅拌均匀，标记好配制时间和成分，备用。

        （2）分装PBS：将PBS从瓶中倒入50mL离心管，注意瓶口与管口不要接触，避免污染，标记后置于试剂架备用。

3、细胞消化及传代：

        （1）细胞状态检查：手部酒精喷洗后，取出培养皿或瓶子，放在倒置显微镜下检查细胞密度，80%-90%密度时即可传代。酒精喷洗手部并处理培养皿后，将其放入超净台。

        （2）清洗：移除原有培养液后，用移液枪加入2mL PBS清洗1-2次，轻轻晃动培养皿，去除残余液体和悬浮细胞。弃PBS时要确保枪头高于废液缸，避免污染。

        （3）消化：在培养皿边缘加入1-2mL胰酶，消化2-5分钟，待细胞形态从不规则变为圆形时，消化完成。

        （4）终止消化：加入3mL完全培养基终止消化，或直接移除胰酶。用移液枪轻轻吹打培养皿底壁，使细胞脱离。

        （5）离心：将培养液转移至15mL离心管，1000rpm离心5分钟，得到细胞沉淀。

        （6）培养皿准备：在离心过程中，准备所需培养皿，加入9mL完全培养基，并标记好细胞种类、代数、传代时间及操作人员。

        （7）细胞复苏：去除离心上清，加入2-3mL完全培养基重悬细胞，将细胞分装入培养皿，并在显微镜下检查细胞密度。培养皿（10cm皿：10mL培养基，T25瓶：5mL培养基），酒精喷洗后放入恒温箱。

4、结束操作：

        （1）将未用完的试剂封口并移出超净台，废液与耗材一并处理。

        （2）清洁移液枪及耗材，用酒精湿润吸水纸擦拭超净台，关闭台灯。

        （3）废液倒入回收瓶，废弃物装入黄色垃圾袋，待统一回收。试剂放回4℃冰箱冷藏。

        （4）记录实验操作内容及结果，方便后续查阅。

03 注意事项

 

1、细胞消化中的注意事项

        （1）消化细胞可能会由于商品化胰酶的品牌、实验室温度或细胞种类等造成消化时间上的差异，建议首次消化细胞时在加入胰酶后就转移至倒置显微镜下观察细胞状态并记录时间。

        （2）消化细胞熟练之后可以观察到消化完成后的培养皿或培养瓶底壁呈现雾面。

        （3）若5mins后细胞状态没有明显变化，可以将培养皿重新放回培养箱在37℃下孵育消化，或者更换别的品牌的胰酶尝试。

        （4）若消化过度则细胞会随着分散在胰酶中，此时弃去胰酶终止消化会造成细胞的损失，应加入含血清的培养基终止消化后离心去除。

        （5）若细胞消化未完全就终止消化，细胞会贴在皿底很难吹打下来，可以再加入胰酶重新消化。

2、细胞传代时的注意事项

        （1）首先可以在ATCC上查找细胞的传代比例，然后根据细胞培养的状态判断传代的合适比例。若细胞传代过稀则可能会导致细胞不能扩增，若过密则影响细胞生长状态。

        （2）细胞传代天数的控制也很重要。若长时间不传代，细胞培养基颜色变黄，则证明培养基中的pH发生变化，会影响细胞状态。

 

        声明：本文使用图片来源于网络和文献，如有侵权请联系删除。