概述

        将小梁骨切成2~5mm³的小块，置于胶原酶和胰蛋白酶中消化，获得细胞悬液，接种培养。

用品

        (1)常规培养器具、解剖刀、钳等。

        (2)Ham’s F12培养液，加12%胎牛血清、2.3 mmol/L Mg²⁺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL,链霉素。

        (3)胰蛋白酶液:125mg胰蛋白酶溶于50mL无Ca²⁺，Mg²⁺的 Hanks 液中,调pH至7.0，过滤除菌，用Pyrex管(硬质玻璃管)分装成5mL及10mL，储存于-20℃备用。

        (4)骨细胞消化液:

        a液:NaCl 8.0 g,KCl 0. 2 g,NaH₂POHO₄ 0.05 g，溶于100 mL 蒸馏水。

        b液(胶原酶-胰蛋白酶液):I型胶原酶137mg，胰蛋白酶50mg溶于10mL a液中，调整pH至7.2，加蒸馏水至100mL，过滤除菌，制得骨细胞消化液，分装为10mL，储存于-20℃。

        (5)9cm培养皿，25cm²或75cm²培养瓶。

步骤

        (1)无菌条件下用a液反复洗涤小梁骨标本以去除脂肪组织，再用a液冲洗去除残余血和脂肪细胞。

        (2)切碎骨标本制成2~5mm³碎块用含胎牛血清的培养液再洗涤。把洗涤过的骨碎块放入骨细胞消化液b中，消化液的量至少要全部浸没骨碎块，在带磁力搅拌的容器中室温下消化45min。

        (3)弃除首次消化所得的悬液，因为其中主要含有成纤维细胞。再加入适量骨细胞消化液b，室温下磁力搅拌消化30min。静置数分钟，收集消化液，去除碎骨块，室温下离心580g，2min。

        (4)去除上清液，细胞计数，将细胞悬浮于含20%胎牛血清的Ham's F12培养液中，离心580g，10min，弃上清，用4mL完全培养液重新悬浮细胞用于培养。

        (5)用75cm²的培养瓶，含有完全培养液8mL，置入CO₂孵箱预培养20min。

        (6)弃去预培养液，加2mL完全培养液，然后加入4mL消化所得细胞悬液再加入6mL完全培养液，使每瓶液体量达 12 mL。

操作提示

        如果切取的标本量多，可适当增加消化液的量、消化次数及消化时间(可延长至1~3h)，每次消化后所得悬液可分别计数并分别培养。