破骨细胞的前体来源目前尚无定论，但许多研究表明脾脏和骨髓中的单个核细胞可以互相融合形成多核的破骨细胞随血流到达破骨细胞活动活跃的部位，在新生动物的长骨内面反复冲洗或用胶原酶消化新生动物的颅盖骨，都可获得破骨细胞，用骨髓培养法也可使单个核细胞分化为破骨细胞。

1、 四肢长骨机械分离法

概述

        破骨细胞附着在四肢长骨骨干内表面，用机械冲洗法获得的悬液中含有破骨细胞，可用于培养。

用品

        同常规组织块法。

步骤

        (1)骨标本主要来源是出生2h以内的新生免或鼠，断头处死后取其四肢长骨，将骨干在含Hepes缓冲液的M199培养液(加有15%胎牛血清和适量抗生素)的培养皿中纵形剖开，用吸管吸取培养液反复冲洗骨髓和骨干的内表面，使附着在骨内面的细胞游离出来，静置使骨碎片沉降，悬液内即含有破骨细胞。

        (2)将悬液分装于培养瓶中，37℃、5%CO₂条件下培养1~3h，破骨细胞即贴于瓶壁。

        (3)冲洗去除未贴壁的细胞(主要为红细胞)，加适量培养液，继续培养。

2 、下蛋母鸡长骨分离法

概述

        下蛋母鸡在缺钙情况下骨内膜中破骨细胞数量增加，可从其长骨骨内膜获得破骨细胞进行培养。

用品

        同常规组织块法。

步骤

        (1)取材前一周给母鸡喂缺钙食物，用CO₂吸入法使鸡致死，取骨，对分离得到的骨标本应彻底去除表面附着的软组织和软骨。

        (2)将骨干放入含0.1%白蛋白，不含钙镁的pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)中，温度0℃~4℃(后面用PBS步骤中也用这个温度)，纵向切开骨干，暴露骨髓，用PBS冲洗3次，在50mL PBS中刮下骨内膜，振荡，制得细胞悬液。

        (3)将细胞悬液通过散装的玻璃棉过滤，去除大骨片，离心(650g，10min)用5mL PBS混匀，在50mL装有7层(每层5mL)梯度液(1.01~1.07mL)的离心管中将细胞悬液离心(650g，20min),用吸取法收集1.05/ml的部分，该部分含破骨细胞多。

        (4)用PBS洗2次，然后用含10%胎牛血清的MEM培养液稀释，37℃，5%CO₂条件下培养，调整初始培养的细胞密度为每平方厘米培养器皿底面积约5000个破骨细胞，24h后冲洗掉未贴壁生长的细胞。

3、颅盖骨消化法

概述

        用胶原酶消化新生或胚胎动物的颅盖骨可获得破骨细胞用于体外培养。

用品

        (1)酶消化原代培养法常规器皿。

        (2)Hanks 液、Hepes 液、灭活胎牛血清、青霉素、链霉素、二性霉素B、1μg/mL胶原酶(溶于M199培养液)MEM培养液。

步骤

        (1)取新生鼠、兔或引产所得人胚胎颅盖骨，用含青、链霉素(100U/mL)的Hanks液冲洗3次。

        (2)用眼科手术剪将骨剪碎，放入1μg/mL胶原酶的M199培养液中，37℃振荡孵育90min，离心(250g，3 min),弃上清，用含Hepes缓冲液(加有15%灭活胎牛血清，100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、300μg/mL二性霉素B)中混匀，洗涤，离心，调整细胞密度大致同上所述，培养在含10%胎牛血清的MEM培养液中。

4、骨髓培养法

概述

        骨髓中的单个核细胞在二羟基维生素D，的作用下可分化为破骨细胞。

用品

        (1)同5.4.6.4节。

        (2)二羟基维生素D₃。

步骤

        (1)若用于人，在局部麻醉下用含有5m培养液和肝素(100U/mL)的20mL注射器从髂后棘抽取骨髓;若用于动物，取管状骨骨髓。将取得的骨髓立即加入含适量肝素的培养液中，振荡，避免血凝块形成。

        (2)然后放入梯度液中，离心，用吸管吸取单个核细胞部分，分散在含30%热灭活马血清的RPMI 1640培养液中。

        (3)培养开始的细胞数以较大密度为宜，培养条件为37℃，饱和温度，含5%CO₂，培养液中加入10^-6mol/L二羟基维生素D₃，每周换液1/2。培养起初只有圆形单个核细胞生长;1周后可观察到体积大，含多个核的细胞，2~3周后这种细胞的数量明显增加。

操作提示

        从四肢长骨和颅盖骨获得的培养中往往有纤维细胞和成骨细胞与破骨细胞共同生长，且破骨细胞数量较少;用骨髓单个核细胞培养法可获得较多的破骨细胞，但也有其他骨髓细胞混杂生长。目前尚未见到纯粹破骨细胞培养及破骨细胞传代培养的报道。

结果及鉴定

        (1)形态观察：破骨细胞形态特点是体积大，含多个核。细胞直径可达20~100μm，一个细胞含核数可为2~100个甚至更多。在倒置显微镜下直接观察或经细胞染色光镜下观察均可。

        (2)细胞组织化学染色法：破骨细胞与抗酒石酸磷酸酶(TRACP)反应呈棕色与降钙素反应呈蓝紫色，与破骨细胞单克隆抗体免疫荧光染色呈阳性。这三种阳性反应是已被公认的鉴别破骨细胞的重要标志。

        (3)细胞功能观察：破骨细胞与失活的皮质骨骨片或牙骨质片(厚度约100μm)共同培养，连续观察可发现破骨细胞使骨片或牙骨质片上形成不断增大的吸收陷凹。