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普通PCR(聚合酶链式反应)
更新时间: 2024-12-05 16:35

一、实验原理

普通PCR(聚合酶链式反应)是一种用于在体外扩增特定DNA片段的技术。PCR的原理是基于DNA复制的过程,主要利用DNA模板、引物、四种脱氧核糖核酸三磷酸(dNTPs)和DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。PCR反应包括三个基本步骤:变性、退火和延伸。

变性:将DNA模板加热至94-98°C,使双链DNA解旋为单链,以便后续的引物结合。

退火:将温度降低至50-65°C,使引物与各自的互补序列结合。 延伸:在72°C左右,DNA聚合酶开始从引物的3’端开始合成新的DNA链。

二、实验流程

1. 样本准备:

  • 组织样本:将组织样本匀浆化,使用DNA提取试剂盒提取DNA。
  • 细胞样本:收集细胞,使用裂解缓冲液裂解细胞,提取DNA。
  • 血液样本:使用EDTA抗凝管收集血液,提取DNA。

2. DNA纯化与定量:

  • 对提取的DNA进行纯化,去除杂质和蛋白质。
  • 使用分光光度计或荧光定量PCR仪对DNA进行定量

3. PCR反应混合物的准备:

  • 在PCR管中加入PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、模板DNA和DNA聚合酶。

4. PCR扩增:

  • 将PCR管放入PCR仪器中,按照预定的程序进行变性、退火和延伸的循环。
  • 循环次数通常为25—35次,具体取决于目标片段的大小和扩增效率。

5. PCR产物的分析:

  • 扩增后的PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行分析,以确认扩增是否成功以及产物的纯度和大小。

6. 数据记录与报告:

  • 记录实验结果,包括PCR产物的电泳图和大小。
  • 根据实验结果撰写报告。

三、送样要求

1、样本类型:组织、细胞或血液。

2、样本保存:DNA样本通常需要在-20°C或-80°C下保存,并在运输过程中使用干冰或冰袋。

3、样本纯度:要求提取的DNA样本足够纯净,无蛋白质、脂质或其他杂质污染。

4、 样本浓度:DNA浓度应适合PCR反应,通常在10-100 ng/µL范围内。

5、避免降解:确保在样本处理和运输过程中避免DNA的降解。

6、标签和记录:每个样本应清晰标记,并记录相关信息,如样本来源、提取日期和纯度等。