概述

        以往认为，巨噬细胞是一种参与非特异性免疫和特异性免疫的吞噬细胞和抗原提呈细胞，主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用(吞噬及消化)，并激活淋巴细胞或其他免疫细胞，令其对病原体做出反应。巨噬细胞主要由骨髓干细胞发育而来，在多集落刺激因子(multi-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(CM-CSF)等刺激下，骨髓干细胞发育成单核母细胞，后者进一步分化为前单核细胞并进入血液循环，在此分化为成熟的单核细胞。单核细胞穿过血管内皮，迁移到不同的组织分化为组织特异性的巨噬细胞。在骨组织内被称为破骨细胞，在肺内被称为Kupffer氏细胞，在脂肪组织内被称为脂肪常驻巨噬细胞。近年的研究发现，巨噬细胞作为一种具有可塑性和多能性的细胞群，在组织器官发育，内稳态的维持，组织的修复与再生中，均发挥重要作用。常用的巨噬细胞来源部位包括：腹腔，骨髓、肺泡等。下面以骨髓巨噬细胞为例介绍培养方法。

用品

        (1)常规原代细胞实验取材所需器具及培养器皿。

        (2)RPMI 1640培养基，胎牛血清，青霉素，链霉素，L-929细胞系，75%乙醇。

        (3)清洗液：DPBS.

步骤

        (1)准备L-929细胞条件培养基：培养L-929细胞，当大约50%汇合时，用无血清RPMI 1640培养基培养5d，收集培养基上清，用0.22μm滤器过滤，分装，-20℃保存。

        (2)准备骨髓巨噬细胞生长培养基：RPMI 1640培养基+10% FBS + 10% L-929条件培养基+100U/mL青霉素链霉素。

        (3)脱颈处死小鼠，将小鼠浸泡在75%乙醇中。腹部中线切口。向外侧牵开，暴露后肢。用剪刀清除骨上的所有肌肉组织。将股骨和胫骨在膝关节处分离，在两端取下股骨，使其游离，确保去除所有的骨周围组织。

        (4)在75%的乙醇中浸泡骨头5min，然后在DPBS中浸泡5min，然后放到加双抗的RPMI 1640培养基中，切断股骨的两端。用1mL 27-G针头或5mL 25-G针头，用骨髓生长培养基冲洗骨髓腔，将骨髓直接推入到15mL的培养皿中。

        (5)每3d更换一次培养基，在培养过程中有些细胞会贴壁，很多细胞仍然悬浮生长，将这些悬浮的细胞离心后在新的培养瓶中培养。

        (6)在10d后，几乎所有的细胞都会变成骨髓来源巨噬细胞，这些骨髓巨噬细胞可用于后续的培养和实验。

操作提示

        (1)使用L-929细胞条件培养基的目的是利用L-929细胞分泌的M-CSF诱导骨髓造血细胞向巨噬细胞分化，因此也可在常规含FBS的培养基中加入20ng/mL M-CSF来替代L-929条件培养基。

        (2)在清除完全游离股骨以及清除周围结缔组织时注意不要造成股骨骨折，因为与此相关的细胞会污染骨髓，很有可能在培养中生长超过巨噬细胞。

        (3)巨噬细胞贴壁很紧，酶消化法和机械刮取法均会损伤细胞。

结果及鉴定

        (1)Ciemsa染色：巨噬细胞的胞体较大，形态多样，胞核较小，呈卵圆形或肾性。胞质丰富，含有空泡和着色颗粒。

        (2)乙酰低密度脂蛋白荧光染色：由于巨噬细胞吞噬荧光标记的低密度脂蛋白，胞质内有红色荧光颗粒。成纤维细胞呈阴性。

        (3)非特异性脂酶染色：巨噬细胞内含有许多褐色颗粒。

        (4)免疫荧光染色：人和大鼠单核-巨噬细胞CD68染色阳性，小鼠F4/80染色阳性，其他细胞为阴性。