基因制约着每个生命个体的一切生命活动，生物体的生、老、病、死等一切生命现象都与基因有关。对基因组的结构、功能等展开的研究我们称为基因组学，基因通过转录形成RNA的过程我们称为转录组学，RNA可以翻译蛋白质，这个过程就是蛋白质组学，蛋白质可以催化产生或作用于代谢产物，也就是代谢组学。

        蛋白质是生物体内承担物质功能的关键分子，可以说在生物学的各个层面上起到了承上启下的作用。近年来，随着质谱技术的不断进步，蛋白质组学也得到了更深入的发展，并衍生出基于各种模式的蛋白质组学研究。接下来，让我们一起来详细了解一下这些进展。

 

 质谱仪是如何检测蛋白质的

 

        常规蛋白质组学通常是从三个维度：离子强度（Intensity）、保留时间（Retention time）和质荷比（m/z）对蛋白质进行定性与定量。

        接下来，让我们详细了解一下蛋白质组学分析的过程：

        在提取蛋白质后，首先会进行酶解、除盐等操作，将蛋白质分解成肽段。接着，使用高效液相色谱（HPLC）进行分离和分级。在进入质谱仪之前，样品会通过离子源装置进行离子化，肽段带上电荷。然后，离子化后的肽段（通常称为母离子，其中一个母离子可能包含一个或多个蛋白质）进入质谱仪。

        质谱仪的核心部件是质量分析器，可以理解为一个真空环境下，带有电场和磁场的装置。当离子化后的肽段进入质量分析器时，由于它们各自的质荷比（m/z）不同，它们在电场或磁场中的运动轨迹也不同。因此，质量分析器可以通过检测器记录离子的运动时间和位置，进而计算出质荷比。

        最终，质谱仪生成一张质荷比从左到右逐渐增大的谱图，称为一级质谱图。在一级质谱图中，每一个母离子会形成一个离子峰，离子峰的面积代表着母离子的丰度，进而反映出蛋白质的相对含量。因此，一级质谱图可用于对蛋白质进行定量分析。

        通过一级质谱，我们可以了解蛋白质的相对含量，但要进一步确定这些蛋白质的身份，就需要通过二级质谱进行定性分析。

        二级质谱的主要目的是定性分析。其基本原理是将一级质谱中分离出的母离子进一步裂解，产生二级离子。这些二级离子能提供更多关于目标化合物的信息，比如分子结构、化学键等。通过与已知的二级离子谱图进行比对，或者利用化学计量学方法解析二级质谱数据，我们可以确定目标化合物的结构，从而对蛋白质进行定性分析，帮助我们确认样品中包含的具体蛋白质。

蛋白质组学的划分

 

        蛋白质组学的主要研究目的包括：分析哪些蛋白质在特定条件下被表达、蛋白质的表达量变化、蛋白的翻译后修饰、以及蛋白质之间的相互作用等。

        根据不同的划分方式，蛋白质组学可以分为以下几种类型：

蛋白质定性分析：主要用于确定样品中存在的蛋白质种类，识别蛋白质的类型和结构特征。

相对定量蛋白质组学：通过比较不同条件下蛋白质的丰度变化，分析蛋白质表达的变化趋势。

全息扫描蛋白质组学：综合分析整个蛋白质组的特征，利用高通量技术全面扫描和鉴定蛋白质组。

靶向蛋白质组学：针对特定的蛋白质或蛋白质组进行详细分析，关注特定目标蛋白的功能和变化。

微量蛋白质组学：主要应用于低丰度蛋白质的分析，针对样品中少量的蛋白质进行高灵敏度的检测和定量。

 

蛋白质定性（Shotgun鸟枪法）

 

        Shotgun（鸟枪法）是一种常见的蛋白质鉴定方法，通常用于分析蛋白质混合物中的蛋白质组成。其基本原理是将蛋白质经过蛋白胰酶酶解，形成肽段，然后通过高效液相色谱（HPLC）进行分离，并进入质谱进行检测。在二级质谱中，肽段会被碎裂，产生碎裂片段。通过将这些碎片的信号与理论肽段碎裂片段进行比对，可以实现肽段的定性分析（即氨基酸序列的确认），最终达到对蛋白质的定性鉴定。

应用方向：

蛋白胶点胶条鉴定

相互作用蛋白鉴定

全蛋白质组鉴定

技术特点：

        1.适用于各类样本的蛋白质鉴定：特别适合对蛋白电泳考染胶条或银染胶条（需确保银染试剂与质谱兼容）、免疫沉淀（IP）、共免疫沉淀（CO-IP）以及拉下（Pull-Down）洗脱液等样本中的蛋白质进行鉴定。

        2.样本需求低：由于该方法主要进行蛋白质的定性鉴定，而非定量分析，因此仅需微量样本即可满足实验需求。

 

标记定量蛋白质组学（iTRAQ/TMT）

 

        标记定量蛋白质组学通过使用化学试剂与蛋白质或多肽的N端或赖氨酸残基进行共价结合，从而实现对蛋白质或多肽的标记。常见的标记技术包括iTRAQ和TMT，它们的原理基本相似，主要区别在于可以同时检测的样本数量。iTRAQ采用4、6、8种同位素标签，每种标签标记一个样本，而TMT则采用6、10、16、18种同位素标签，可同时比较最多18个样品之间的蛋白质表达量。

技术原理：

        1.TMT同位素标签由三个部分组成：质量报告基团（Mass Reporter）、氨基反应基团（Amine-reactive Group）和质量平衡基团（Mass Normalizer）。在TMT检测过程中，氨基反应基团与样本中蛋白肽段的N末端或末端赖氨酸侧链基团的游离氨基进行共价结合，成功标记上TMT标签的肽段随后进入质谱检测。

        2.在串联质谱的检测中，由于不同TMT标签对应不同质量的报告基团，一级质谱可以通过质量平衡基团使得不同样本中的同一肽段具有相同的质荷比（m/z），从而在质谱中表现出相同的信号。进入二级质谱后，由于肽段中的质量报告基团会碎裂并释放出来，报告离子峰将在质谱低质量区产生。通过质谱检测不同报告基团的离子信号，便可以获得不同样本之间相同肽段的定量信息。

 

技术特点：

        1.定量准确，高可重复性：通过对不同样本的肽段进行标记并等量混合，统一分级后进行质谱检测，避免了非标记蛋白质组学中单独样本上机可能导致的误差，从而显著提高了定量的准确性和重复性。

        2.更高的鉴定深度：与传统的3D label free方法相比，标记定量蛋白质组学可以提高蛋白质鉴定数目20%~50%；其鉴定能力与4D label free方法相当。

        3.不适用于蛋白质总量极低的样本分析：该方法不适用于蛋白质总量非常低的样本，也不适合用于蛋白质绝对有无的差异比较分析。

 

非标记定量蛋白质组学（Label-free）

 

        与iTRAQ和TMT的多肽体外标记定量技术不同，Label free属于非标记定量蛋白质组学，无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准，每个样品单独上机，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。

 

技术特点：

        1.无需依赖同位素标记，每例单独检测，因此实验设计灵活，适合临床大样本，几十例、上百例样本的检测，能检测到样本中绝对的“有还是无”的蛋白。     

        2.对仪器的稳定性、实验人员的操作等可能产生系统误差的因素要求极高。

 

DDA VS DIA

 

        DDA（数据依赖性采集）与DIA（数据非依赖性采集）是质谱分析中常用的两种二级质谱数据采集模式。

DDA（数据依赖性采集）：

        DDA是一种选择性数据采集模式，它是质谱内部的选择过程。DDA根据当前扫描到的所有母离子的信号强度来决定哪些母离子会进入二级质谱进行碎裂。换句话说，DDA模式通过选择性地对丰度较高的母离子进行碎裂和定性分析，从而实现蛋白质的定性。通常，在一级质谱中，根据信号的强度（离子峰的面积），DDA模式会选择丰度排名前10-20的母离子进行二级质谱分析。由于DDA只选择部分高丰度的离子进行分析，因此低丰度的蛋白质可能会被遗漏。由于二级质谱的检测依赖于一级质谱的数据，因此也被称为数据依赖性采集模式。相对定量蛋白质组学方法，如iTRAQ、TMT和Label-free，通常基于DDA模式。

DIA（数据非依赖性采集）：

        DIA是一种全扫描质谱数据采集模式，是近年来发展起来的一种新型质谱技术，属于非标记蛋白质组学方法。DIA模式将质谱的整个扫描范围分为若干个窗口，然后对每个窗口中的所有离子进行检测和碎裂，从而全面、无遗漏地获得样本中所有离子的质谱数据。简而言之，DIA会对一级质谱中检测到的所有母离子进行碎裂并进行二级质谱分析，这样能够大大提高蛋白质的检出率。与DDA模式相比，DIA模式避免了低丰度蛋白质的遗漏，提高了定量的准确性和重复性，降低了样本检测的缺失值。因此，DIA模式能够在大样本队列中进行高稳定性和高精准度的蛋白质组定量分析。

        总结来说，DDA模式通过选择性采集母离子数据，适合较小规模样本的分析，但可能遗漏低丰度蛋白；而DIA模式通过全扫描方式分析所有离子，能够确保全面的蛋白质检测和高精度定量分析。

 

 3D蛋白质组学 VS 4D蛋白质组学

 

        常规蛋白质组学通常是从三个维度：离子强度（Intensity）、保留时间（Retention time）和质荷比（m/z）对蛋白质进行定性与定量。那么在检测的过程中一些质荷比（m/z）比较接近的肽段和同分异构体肽，质谱在检测时很容易会认为是同一种，从而造成遗漏。相对于传统蛋白质组学技术，基于timsTOF Pro2的4D-蛋白质组学平台，在前三个维度的基础上增加了第四个维度，离子淌度（mobility）可以对离子的形状和截面进行分离，能够区分m/z差值非常小的离子，大幅度提高扫描速度和检测灵敏度。

 技术特点：

        1.更高的鉴定深度：助力更多肽段和蛋白的鉴定，蛋白鉴定数提高50%~100%

        2.更适合微量样本：比常规TMT技术要求的送样量少50%～80%，能够满足临床珍贵、微量样本的蛋白组分析需求。

        3.更高的准确度：离子淌度能够有效区分共洗脱肽段/同分异构体肽，比传统label free技术鉴定结果更可靠、准确。

 

靶向蛋白质组学（PRM）

 

        Parallel Reaction Monitoring（PRM，平行反应监测技术）是一种针对目标蛋白质进行定量检测的靶向质谱技术。通过对特异性肽段或目标肽段进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/修饰肽段的靶向相对或绝对定量。由于PRM技术不依赖于抗体，且能在单次检测中实现几十种甚至上百种蛋白质的定量，因此，PRM是目前进行大规模样本或者大量蛋白质验证的优先推荐技术。

        那么如何验证蛋白质组学结果的准确性，我们可以通过常规手段WB、ELISA等，也可以通过组学手段：PRM。那么我们接下来就比较一下WB/ELISA与PRM的区别：

PRM与WB/ELISA的对比

 

微量蛋白质组学

 

        基于质谱的蛋白质组学方法能够实现对蛋白质的定性和定量，以及复杂样本中的翻译后修饰测定，但是，常规的蛋白质组学需要大量样本，比如细胞需要5×10⁶，组织需要30mg。对于一些特殊的样本类型，比如流式分选的细胞、原代培养细胞，以及一些临床穿刺组织、玻璃体等，这些样品类型珍贵、不易获取、样本量少，往往达不到常规蛋白质组学对于样本量的要求。微量蛋白质组学能够对蛋白肽段进一步提取，结合4D-DIA全息扫描技术实现对微量样本深度检测的蛋白质组学。

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