概述

大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞简称 AT-Ⅱ对维持正常的肺功能发挥重要的作用。体外培养AT-Ⅱ是研究其特性的重要手段，由于培养难度较大，不易获得较高纯度细胞，培养后表型丧失快，尚无传代培养报道。

用品

（1）Wistar大鼠肺组织。

（2）培养基：DMEM中添加10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、10mmo1/LHepes、100U/mL青霉素、100ɥg/mL链霉素。

（3）3%戊巴比妥钠10mg/kg、肝素400 U/kg 抗凝。

（4）肺泡灌洗液I：包括140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2.5 mmol/L Na₂HPO₄ 12H₂O、10 mmol/L Hepes、6 mmol/L 葡萄糖、0.2 mmo/L EDTA，用无菌双蒸水配制，pH7.4。肺泡灌洗液Ⅱ：包括肺泡灌洗液Ⅰ，再加入2.0 mmol/L CaCl₂和1.3 mmol/L MgSO₄，混匀备用，肺泡灌洗液在使用时须预热到37℃

（5）120目、200目滤网、培养皿或瓶、手术刀、眼科剪、镊。

（6）消化液和细胞分散液：0.25%胰蛋白酶、100ɥg/mL的DNase和4%的胎牛血清。

（7）大鼠IgG：用于包被培养器皿，目的是提高细胞纯度。临用时以50mmol/L的Tris缓冲液（pH9.3）稀释配制。

步骤

（1）Wistar大鼠麻醉，抗凝，气管插管，放血活杀。经肺动脉用肺泡灌洗溶液Ⅱ洗肺，气管通气8次，用溶液I、Ⅱ分别经气管插管灌洗肺，用溶液Ⅱ灌洗胸腔。

（2）取出心肺、气管，经气管插管注入0.25%胰蛋白酶20mL，37℃水浴20min。在含有4mL DNase的小烧杯中剪碎肺组织。然后加入5m胎牛血清、溶液Ⅱ 20mL后倒入烧瓶，37℃水浴并晃动5 min。

（3）120、200目滤网过滤，离心后弃上清，重悬细胞。将悬液加入已用大鼠IgG包被的DMEM培养瓶中培养3h。

（4）收集细胞悬液，以400g离心8～10min，弃上清，再用无血清的DMEM培养液漂洗1次，用20%胎牛血清DMEM培养瓶悬浮细胞，计数并进行细胞活力的测定。

（5）以适当的密度接种于培养瓶或培养板中，24h后更换培养液继续培养。

操作提示

（1）肺泡灌洗液充分的灌洗应充分使用IgG包被培养皿底壁，均有助于上皮细胞的纯化，清除巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的污染

（2）肺是一个开放性器官，容易出现细菌污染，因此取材时需注意无菌操作在早期培养时应使用含抗生素的培养液此外，灌洗液中加入抗生素也可降低细菌污染的风险。

结果及鉴定

原代培养18～24h后，Ⅱ型肺泡细胞大量贴壁，培养36～48h细胞伸展呈多形性，并相互连接成单层细胞，细胞内出现大量反差明显的颗粒，72h后颗粒逐渐减少，5～7d后颗粒减少甚至消失。

电镜下可清楚观察到胞质中粗面内质网和高尔基复合体等细胞器，可见不均匀地分布在核周的大小不一的褐色的嗜锇小体（板层小体）；组织细胞化学方法检测Ⅱ型肺泡细胞碱性磷酸酶活性，可观察到胞质中有较多分布不均，大小不一的蓝色颗粒；免疫组化染色肺表面活性物质相关蛋白A阳性。