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概述
肾小管上皮细胞培养的要点是从基质中可以分离出肾小管细胞,因为这些细胞含有D-氨基酸氧化酶,能够在D-缬氨酸中生长,基质细胞则不可,用帘式电泳(curtain electrophoresis)和强力沉降法也可将肾小管细胞和基质细胞分开;用胶原酶消化切碎的肾脏组织10h左右,再用吸管吹打则可获得肾小管及肾小球上皮细胞。可将此过程重复2~3遍以增加所获得的细胞数量,常规培养。
用品
(1)Wistar大鼠,重约50g。
(2)RPMI1640,新生小牛血清,2%胰蛋白酶,胰岛素(5ɥg/mL),氢化可的松(36ng/mL),人转铁蛋白(5ɥg/mL)表皮生长因子(10ɥg/mL)等。
(3)80目、100目不锈钢筛网或尼龙网,培养皿、培养瓶。
步骤
(1)实验前12h大鼠禁食,自由进水;处死后无菌取肾。
(2)置于生理盐水的培养皿中(25℃)分离、剪碎肾皮质并置于80目不锈钢网筛,研磨并以生理盐水充分冲洗,网下液体倒至100目不锈钢筛网上,收集网上物于培养皿中,充分吹打后,离心1000r/min,持续10min。
(3)离心后弃上清液,加入0.2%胰蛋白酶1.5~2.0mL,充分吹打混匀消化液与离心物,置于37℃振动水浴中,消化20min,离心1500r/min,5min,弃上清后加入5mL含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养液,充分吹打混匀后移入培养瓶中。在37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养。
(4)原代培养第5至6天,细胞完全铺满瓶底。倒空瓶内培养液,加入少许无血清RPMI 1640培养液,摇动使之浸润所有细胞后倒出,滴加0.25%胰蛋白酶,液量能覆盖瓶底所有细胞即可,置孵箱中3~5 min,约85%细胞收缩、变圆、少许脱落,立即加入双倍量含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养液,轻摇混匀,以弯头吸管顺瓶底依次轻轻吹打,离心1500r/min,5min,弃上清,加入含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养液,充分吹打混匀,细胞计数后分别装入培养瓶中传代培养。
(5)首次传代的细胞于传代后第2天贴壁,第5至6天更换培养液,第12至14天细胞铺满瓶底,可顺次传至第13至18代,其后细胞贴壁逐渐减少。
操作提示
培养的肾上皮细胞中可能混杂有成纤维细胞,可通过差速贴壁分离法去除成纤维细胞。
结果及鉴定
所获得肾小管和肾小球上皮细胞形态为多边鹅卵石样,体积较大,镜下透明度及折光性强,各细胞互相紧密衔接,可见融合成片及复层生长;较分散细胞贴壁后形态不一,体积增大,较为伸展,镜下透明度增大而折光减弱。免疫细胞化学染色角蛋白18阳性表达。