肝实质由大量肝细胞组成，含间质少，肝细胞具有多种功能，代谢旺盛，在体外培养所需条件高。可取材于动物或人，用组织块法和原位灌注消化法均可获得肝细胞用于原代培养。肝细胞形态比较规整，体外培养时仍具有多种功能，适用于实验研究。持续旋转培养聚集肝细胞法培养的肝细胞相互调节作用更类似于体内的三维环境，有利于维持其活性和发挥生物学功能。下面以鼠肝、猪肝细胞培养为例说明。

 

（一）鼠肝脏组织块法

概述

肝的组织块法与其他组织相同，而且易于贴壁，一般次日即有细胞从组织块长出。用改良低血清培养基可获得纯度>95%原代小鼠肝细胞。

用品

（1）2~4周龄BALB/c小鼠，雌雄不限。

（2）试剂：D-Hanks液；消化液I：含1g/L胰蛋白酶、10g/L聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrolidone,PVP）及3g/LEDTA；消化液Ⅱ：含2g/L胶原酶Ⅳ及10g/L PVP；基础培养液为DMEM，含青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL、50mmol/L Hepes、30g/L谷氨酰胺；小牛血清（BS）；培养基内其他因子：胰岛素5μg/mL、转铁蛋白5μg/mL、促甲状腺素释放因子1x10^-6mol/L、促肝细胞生长因子1x20μg/mL、氢化可的松1x10^-6mol/L。

（3）水浴箱、吸管、培养瓶、手术刀、眼科剪、眼科镊等。

步骤

（1）断头处死鼠，无菌分离肝组织。在冰浴下将肝组织用4℃D-Hanks液或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分，将肝组织切为约1mm³小块。

（2）用上述液体尽量洗去残留血污最后1次清洗后800/min离心4min，弃上清，加入消化液Ⅰ，37℃孵育12min再用培养液洗3次以清除胰酶。将消化好的肝组织块贴于25cm²培养瓶中，加少许含100mL/L BS培养液置37℃、5%CO₂条件下2～3h后再补充6mL含100mL/L BS的培养液，待组织块周围出现细胞“生长晕”后改为含50mL/L BS的培养液。

（3）细胞生长至单层状时加入消化液Ⅱ，置4℃消化过夜，去除消化液，加含100mL/L BS的培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4℃、50g离心4min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%，按5x10⁵/mL，细胞密度接种，于37℃、5%CO₂条件下培养，待细胞贴壁生长后改为含50mL/L BS的培养液。

 

（二）鼠肝脏原位灌注法

概述

鼠的肝脏灌流法为分离肝细胞的经典方法。

用品

（1）蠕动泵（10~20r/min）、水浴槽、无菌血管套管、一次性20号头皮静脉输液针、缝合线、计时器、无菌刻度试管、培养皿、无菌外科手术器械（直剪弯剪及夹子）、1mL注射器

（2）无钙Hepes缓冲液：pH7.65、168.8 mmol/L NaCl、3.15 mmol/L KCl 0.7 mmol/L Na₂HPO₄ 12H₂O、33 mmol/IHepes，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃储存（有效期可达两个月）。

（3）胶原酶溶液：0.025%胶原酶0.075% CaCl₂ 2H₂O、溶于pH7.65无钙Hepes缓冲液，使用前即刻配制并过滤除菌。

（4）肝素。

（5）LeibovitzL 15或RPMI 1640培养液。

步骤

（1）在38℃~39℃的水浴槽中预热Hepes缓冲液和胶原酶液，使其在肝内达到 37℃。

（2）给大鼠（180～200g）腹腔注射巴比妥钠（1μL/g），从股静脉注射肝素（1000U）。打开腹腔，在门静脉的肝外5mm处松松的放置一个结扎线环，将血管套管插入至肝脏，结扎。快速切开肝下血管以免压力过高，灌注500m无钙Hepes缓冲液，流速为30m/min（将蠕动泵流速调至30m/min），数秒钟内肝脏即变白。

（3）灌注300mL胶原酶液，流速为15mL/min，持续20min，肝脏肿大。

（4）切下肝脏，用Hepes缓冲液清洗，切开肝纤维囊，收集消化清洗液并混入100mL Leibovitz L 15培养液中，该悬液中含大量肝细胞。

（5）用两层纱布或60~80μm尼龙筛过滤细胞悬液，静置，使活细胞沉降20min（室温下）去除含组织碎屑和死细胞的上清液（约60mL）。

（6）低速离心法清洗细胞（50g,40s）3次以去除胶原酶、破坏了的细胞以及非肝实质来源的细胞。

（7）将细胞收集在培养液F12中（含0.2%牛血清白蛋白、10μg/mL牛胰岛素），CO₂孵箱内培养。

（8）传代培养：细胞长满时，先用BSS洗1～2次，再用1:1的0.05%胰蛋白酶和0.025%EDTA混合液消化5～10min，吸除消化液，轻轻洗细胞层，加适量培养液，用吸管吹打成细胞悬液，接种培养。

 

（三）猪肝脏原位灌注法

概述

这是近年来建立的一种较为完善的肝细胞培养体系，可获得较多肝细胞并长期培养。

用品

（1）本地杂种猪，体重5～10kg，雌雄不限，1~2月龄。

（2）试剂：胰岛素、胰高血糖素、转铁蛋白、氢化可的松、Ⅰ型胶原酶、台盼蓝、鼠尾胶原、肝素等。

（3）肝脏灌注液配制：灌注液Ⅰ(8.3g NaCl、0.5g KCl、0.22g NaOH、2.4gHepes、双蒸水1L，pH7.4)；灌注液Ⅱ(3.9g NaCl、0.5g KCI、2.6.gNaOH、0.53g CaCl₂、24g Hepes、0.5gⅠ型胶原酶、双蒸水1L，pH7.4~7.6)；灌注液Ⅲ(4.0g NaCl、0.4g KCI、2.1gNaOH、0.136g CaCl₂、0.13g MgCl₂、0.1g Na₂SO₄、7.2g Hepes、6.5g Tricine、6.9g TES、双蒸水1L，pH7.4)；灌注液Ⅳ(8.3g NaCl、0.5g KCl、0.11g NaOH、0.136gCaCl₂、2.4gHepes、双蒸水1L,pH7.4)。

(4)24孔培养板、常规手术器械150μm、100μm、80μm滤网。

步骤

（1）猪肝细胞的分离培养：实验猪术前12h禁食，用30g/L的戊巴比妥钠按50mg/kg腹腔注射麻醉，腹部备皮消毒打开腹腔，暴露门静脉及下腔静脉，于下腔静脉内注射125U肝素

（2）分离门静脉、下腔静脉。门静脉分离后，分别行近心端和远心端插管固定，近心端供肝脏灌注用，远心端插管供抽取门静脉血用，每3～5min抽吸1次：每次尽量抽取干净。分别结扎其远心端近心端插管并固定，在肝静脉上端结扎下腔静脉。

（3）分别用经37℃水浴预热的灌注液I、Ⅱ经门静脉、下腔静脉循环灌注，灌注流速为50～60L/min，至肝脏变为苍白或黄白色，灌注时间约20min左右。

（4）取下消化充分的肝脏，切开肝包膜，将消化分离的肝细胞悬液收集到经37℃水浴预热的Ⅲ液中。

（5）分别经150μm、100μm、80μm滤网过滤，制备成粗制肝细胞悬液然后以1000r/min离心3～5min，共离心3次，把沉淀的肝细胞加入Ⅳ液中制备成肝细胞悬液备用。

（6）肝细胞培养：将肝细胞悬液移至无血清培养基中培养，亦可在术中收集到的门静脉血清中培养。取猪肝细胞悬液1mL，含肝细胞的细胞密度为3x10⁵个接种于已经铺好鼠尾胶原的24孔培养板中，并加2mL含有100μg/L胰高血糖素、100μg/L转铁蛋白、200μ/L氢化可的松、100μg/L胰岛素、200μg/L头孢他啶的无血清DMEM培养基或胎牛血清培养基中培养。

（7）置于恒温37℃、5%C0₂培养箱中培养，培养24h后去除培养上清，用少量培养液冲洗培养细胞孔3次，加入3mL含上述各因子的DMEM养基继续培养，以后定期进行换液，每次换取新鲜培养基1mL。

用上述方法还可获得啮齿动物（包括小鼠、兔、豚鼠及土拨鼠）的肝细胞，但需要根据肝脏的大小调整灌注液的量和流速。上述方法也可用于分离人肝细胞，所用Hepes液和胶原酶液的量分别为15mI和1000mL，流速分别为30mL/min和70mL/min；若用于手术切除的肝脏，则可根据标本大小，调整灌注流速至15～30mL/min；如果将收集到的细胞重新加胶原酶，37℃轻微搅动下培养10～20min则可获得完全分离的单细胞悬液。

操作提示

（1）采用Percoll梯度离心法能够显著改善获取肝细胞的活性。

（2）用Matrigel胶、Ⅰ型胶原或纤维连接蛋白等基质成分包被培养皿底壁，有利于肝上皮细胞贴壁生长。

结果及鉴定

（1）可根据细胞良好的屈光形态及台盼蓝（2%）排斥试验确认细胞活力，通常从一个大鼠肝中可获得（4~6）X10⁶个活细胞。分离所得的肝实质细胞在悬液中能存活4～6h，可用于短时间的试验。原代组织块培养一般3d后组织块周围有生长晕出现，且逐渐向周围扩展，单层细胞3d后已贴壁生长。光镜下可见培养的肝细胞呈三角形、圆形或类圆形，排列整齐，细胞界限清晰，胞质丰富透亮。细胞核有单核、双核，呈圆形或椭圆形，核仁清晰可见。

（2）培养肝细胞在电镜下可见到细胞间毛细胆管，细胞质中有玫瑰花瓣样糖原颗粒、车轮状线粒体、大量粗面和滑面内质网。培养的细胞分泌白蛋白，并且随培养天数增加分泌量增加，至培养9d时达峰值，随后又逐渐下降。