概述

气道上皮细胞是功能活跃的细胞，不仅构成呼吸道的物理屏障，还具有对化学性毒物或药物的转化代谢作用，有自分泌或旁分泌功能，参与对毗邻细胞功能的调控。在有血清存在的培养条件下，正常人气管上皮细胞停止分裂，也不会最终分化。在无血清培养液（LHC-9）中接种气管组织碎块，可以促进气管上皮细胞的生长，同时抑制纤维细胞的生长。近年来，实验研究所用的气道上皮细胞主要以单纯机械刷洗法或单纯酶消化法获得，联合应用酶消化加刷洗法可增加获取细胞的数量。

用品

（1）培养液：RPMI 1640、DMEM、CMRL 1066或DMEM/Ham(1:1）均可选用。

（2）动物或人的无瘤气管组织。

（3）塑料培养皿、无菌吸管（10m及25mL)；无手术刀片、外科剪、半弯曲钳、手套；混合氧气（50%O₂、45%N₂、5%CO₂)、可控气室、摇床。

（4）人纤黏素/胶原/结晶的牛血清白蛋白（FN/V/BSA)(Lechner and Laveck1985）溶于LHC基本培养液；0.02%胰蛋白酶和0.02%EDTA;1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）混合液。

步骤

（1）用1mL FN/V/BSA混合液涂布6cm培养皿底面，在湿化的36.5℃CO₂，培养箱中至少培养2h，使涂布物固化，但勿超过48h，真空抽吸后加入5mI培养液。

（2）无菌条件下切除无瘤供体的肺组织，放入冰冷的L-15培养液中，运送至实验室，解剖出气管组织，此过程应在12h内完成。

（3）培养前先在培养皿底面边缘用解剖刀刻画出1cm²正方形面积，去除该面积上的FN/V/BSA。

（4）把标本浸入L-15培养液，切开气管，切成1cm²正方形的片状。把片状组织块移入培养皿中刻画出的1cm²面积部位，上皮面向上，注意勿触及上皮面：以免损伤细胞，去除培养液，室温下静置3～5min，使组织块贴附于培养皿底壁。

（5）每皿加入3mL HB培养液，放入可控气室，向气室中注入混合氧气，把气室放在摇床上，以10r/min摇动，使培养液即刻从组织块表面流过，36.5℃培养24h后更换培养液及气室的气体，以后每2d换1次，持续6～8d，这样使组织避免了缺血引起的损伤，以利培养。

（6）用FN/V/BSA涂布皿底面真空吸引，用解剖刀在每个10cm培养皿底面上刻画出7个1cm²面积将上述湿化的组织块上皮面向上接种于培养皿刻画出的范围内，无培养液室温下置3～5h。每皿加入10mL LHC-9培养液，在湿化的5%CO₂孵箱中培养，每3～4d更换培养液。

（7）培养至8～10d，上皮细胞从组织块长出范围超过0.5cm时，将组织块移入新准备的FN/V/BSA 涂布过并经刻画的培养皿，同样条件培养以长出上皮细胞，此过程可重复多达7次。

（8）传代培养时可用胰酶/EDTA/PVP 消化法进行。

操作提示

气管上皮细胞培养目前多采用气液交界面培养的方法，该法更接近于生理气管上皮的生长环境，可培养出呈复层生长且分化更趋成熟的气管上皮细胞，因此在组织块贴附于培养皿底壁后，加入的培养基不宜过多，不宜完全浸没组织块，加入培养基的量以使培养基间歇流经上皮表面即可。

结果及鉴定

培养中的支气管上皮细胞排列紧密呈多边形，培养大约3~6周纤毛开始形成。离体培养一定时间后，细胞形状发生变化，呈梭形或球形，纤毛结构退化或消失。上皮细胞特征性地表达角蛋白和上皮细胞膜抗原，电镜下可观察到上皮细胞的特征性结构如桥粒等。