概述

将获取的胰腺标本修剪切碎后消化并使之浮于牛血清白蛋白溶液之上，经过3次分离离心，收集细胞，在水浴槽中用旋转法使细胞聚集（2～24h），接种于涂布了胶原的培养皿，可获得体外培养的胰腺细胞。

用品

（1）摇动式培养箱；手术刀、眼科剪、镊等；锥形瓶：容积25mL，经硅化处理；尼龙筛：孔径20ɥm和40ɥm；透析袋；5mL或10mL吸管；胶原涂布的培养皿。

（2）HBSS、无Ca²⁺、Mg²⁺ HBSS(HBSS-DVC)、牛血清白蛋白（BSA）。

（3）培养液：F12组织培养液，加20%小牛血清；RPMI 1640培养基，添加10%胎牛血清；青霉素100U/mL、链霉素100ɥg/mL。

（4）Ⅰ型胶原酶：将胶原酶溶于 HBSS-DVC(pH7.2~7.4)，浓度1800U/mL，用20倍体积的HBSS-DVC 4℃透析过夜过滤除菌，分装成10～20mL储存液，保存于-70℃以下。

（5）胰蛋白酶（1:250）0.25%，溶于柠檬酸盐缓冲液，每升含柠檬酸三钠3g、葡萄糖5g，pH7.6。

步骤

（1）将等体积的胰蛋白酶液与胶原酶液混合成细胞分离液。

（2）无菌切取胰脏，放入HBSS，去除间质组织膜及其他多余组织，然后将胰脏切成1～3mm³的碎块。

（3）将5mL预热的细胞分离液移入硅化的25mL锥形瓶，在摇床中37℃ 120/min搅动15min，使大块组织沉降用无菌尼龙筛（孔径40ɥm）过滤上清液该过程重复2～3次，每次都用新鲜的细胞分离液，至胰脏组织几乎全部消化分离。

（4）用孔径20ɥm的尼龙筛再次过滤细胞悬液，过滤时可用轻微的负压吸引装置。

（5）收集过滤的细胞悬液于40mL离心管，计数，250g离心5min，通常从0.4～1.0g胰脏组织中可获得（5~10）x10⁷个细胞。

（6）把细胞重新悬浮于10mL HBSS-DVC中，在另外两个离心管中分别装入35mL 4%BSA（于HBSS-DVC），在每一管BSA溶液上面轻轻地移入5mL细胞悬液，100g离心5min，去除上清，在重复此过程两遍，注意每次离心前都将细胞重新悬浮。

（7）收集细胞团块，移入5～10mL F12培养液中，通常可得到（1~3）x10⁷个活细胞（90%），其中80%～90%为腺细胞。

（8）将细胞悬液转移至硅化的25mL锥形管中，每管5mL，5%CO₂，放在摇床或旋转培养箱中，37℃、转速80r/min培养2～24h。

（9）旋转培养后待细胞沉降聚集3～5h，去上清，用大口吸管将细胞团块重新悬浮在F12培养液中，计数。根据试验需要，细胞接种密度可为1x10²~1x10⁵/cm²，24～48h细胞贴壁，以后形成集落。

操作提示

（1）细胞贴壁后，用含有10ng/mL的胰岛素、5ng/mL转铁蛋白、9ng/mL硒和21ng/mL EGF的无血清MEM替代F12，能维持胰腺细胞生长至少2周，且细胞形态不发生改变。

（2）采用饲养层细胞培养技术，能显著促进细胞的生长。

• 结果及鉴定
• 培养的细胞多数为圆形或多边形，有时还可见到导管样结构。其中30%～40%可判断为腺细胞，在光学和相差显微镜下都可以观察到酶原小滴，
• 用放射免疫检测（RIA）方法可测出上清液中有高浓度的胰岛素水平，免疫荧光标记羊抗人胰岛素抗体可观察到许多荧光反应阳性的胰岛细胞。