概述

      软骨分为生长部和休止部，从这两部分都可以分离出软骨细胞并在体外培养条件下生长。体外培养的休止部软骨细胞形状与纤维细胞相似，无形成软骨基质的能力，对刺激软骨和骨生长的激素、维生素及其他物质不敏感，显示了终末分化细胞的特性。生长部软骨细胞在体外培养条件下代谢较活跃，具有形成软骨基质的功能和成骨细胞的某些特性。软骨细胞埋藏于致密的糖蛋白软骨基质中，必须经过一系列酶消化，才能获得少量细胞，在呈弱碱性并增加Mg²⁺浓度的培养液中易于生长。操作要点是:切碎软骨组织，用透明质酸酶、胰蛋白酶和胶原酶消化两遍以除去基质，再用胶原酶长时间消化，收集细胞，按常规贴壁单层细胞培养法培养于弱碱性的F12培养液中，并增加其中的Mg²⁺浓度。
用品

      除常规培养器具外，尚需以下特殊用液:

      (1)Gey平衡盐溶液(CBSS pH 7.0),为防止污染可加入抗生素，如100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素或50μg/mL庆大霉素、100μg/ml, 制霉菌素。

      (2)F12培养液加12%胎牛血清2.3 mmol/L MgCl₂、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL链霉素，pH7.6。

      (3)0.5%睾丸透明质酸酶，溶于GBSS，加入青霉素100U/mL，链霉素100 μg/mL。

      (4)0.2%胶原酶，溶于CBSS。

      (5)0.2%胰蛋白酶，溶于CBSS。0.25%胰蛋白酶，溶于无Ca²⁺、Mg²⁺的生理盐水。

步骤

      (1)把适量软骨标本放入10cm无菌玻璃平皿中，倒入GBSS淹盖标本为止。用解剖刀将软骨切成1~2mm³的小块移入第二个玻璃平皿，并用 GBSS 淹盖。

      (2)收集全部切碎的软骨，除去GBSS,加入4mL透明质酸酶，室温下作用5min。除去透明质酸酶，另外加入8mL新鲜透明质酸酶室温下作用10min。除去透明质酸酶，用5mL CBSS洗组织碎块2次，然后移入25mL螺口试管中。

      (3)去除GBSS，用胰蛋白酶洗组织碎块2遍，每次用2mL。去除用过的胰蛋白酶，再加新鲜胰蛋白酶4mL，37℃搅拌状态下培养30min。去除胰蛋白酶，用CBSS清洗2遍，每次用5mL。

      (4)用0.2%胶原酶2mL清洗5 min，去除清洗液。加入4mL胶原酶，37℃培养30min，去除上清液。加入4mL胶原酶，37℃，培养90 min。

      (5)将上清液收集，600g离心8 min，获得细胞团。

      (6)把细胞悬浮于8mL F12培养液中(含20%FBS)，180g，离心1min以去除未消化的软骨基质。

      (7)将上清移入另一管，600g离心10 min，收集细胞。

      (8)把细胞悬浮于8mL F12培养液中(含12%FBS)在75cm²培养瓶中培养，添加培养液到12mL。如果组织量多，可重复4~8操作。

操作提示

      (1)软骨细胞可长期培养，但前3代的细胞仍保持软骨细胞的生物学特征，但如果长期培养，细胞会变成梭形，生长能力降低。因此最好利用前3代的软骨细胞。

      (2)培养获得的软骨细胞可放于液氮中冷冻保存，冷冻可降低软骨细胞的抗原性。

结果及鉴定

      体外培养的软骨细胞为多角形，很像上皮样细胞，可形成具有折光性的细胞外基质。原代细胞长满后可传代培养。

      软骨细胞可以特异性地合成葡萄糖胺聚糖(GAG)、Ⅱ型和X型胶原，并具有碱性磷酸酶活性，免疫组织化学染色呈阳性反应，也可测定出其量。细胞外基质经甲苯胺蓝染色呈异染性。