骨骼肌是一种横纹肌，通常是通过肌腱固定到骨骼上，其伸缩可以带动骨骼的移动，促进机体运动。

        肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的丝状肌原纤维，每一肌原纤维都有相间排列的粗肌丝及细肌丝。肌纤维收缩并不是肌纤维中肌丝本身的缩短或卷曲，而是细肌丝在粗肌丝之间滑行的结果，肌丝滑行使肌节长度缩短，肌原纤维缩短表现为肌纤维收缩。

        体外培养大鼠骨骼肌细胞，为临床肌肉损伤的治疗提供理论依据。

01 实验前准备

1. 实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿、15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。
2. 按照含0.2%的XI胶原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的胶原酶进行配制消化液，用0.22微米的PES微孔滤膜进行过滤除菌，置于50毫升离心管中，可直接用于组织消化。瓶口消毒后室温待用。
3. 取出无菌培养皿，分别作好标记，吸取适量PBS置于相应标记的培养皿中。
4. 无菌条件下，准备各种大小的剪刀、止血钳、眼科镊子和手术刀。将断颈处死后浸泡于体积分数为75%乙醇的SD大鼠仰卧在超净工作台内的培养皿上。

02 骨骼肌提取

1. 用剪刀剪开大鼠后肢皮肤，暴露腿部肌肉，用手术刀小心地割取后肢大腿肌肉，同样方法分离另一后肢大腿肌肉。小心剪取表面无附着膜和脂肪组织的肌肉，置于装有PBS的无菌培养皿中。
2. 将剪取的骨骼肌在无菌PBS溶液中，去除脂肪组织后放置于含有消化液的培养皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌组织，成1平方毫米不规则碎片。
3. 轻轻摇匀，室温静置消化30分钟。
4. 收集组织悬液于50毫升离心管中，用消化液反复冲洗培养皿，直至将全部组织块收集到离心管内。
5. 经吹打打匀组织块悬浮液。
6. 配平离心，每分钟1000转，室温离心十分钟。

03 骨骼肌悬液制备及培养

1. 离心后小心去除上清，不要吸到底部的组织块沉淀，用含20%胎牛血清的DMEM培养基重悬，轻轻吹打混匀，均匀转移至六孔板中，轻轻摇匀，标记时间后放于37℃、体积分数为5%的CO₂饱和湿度培养箱中培养。
2. 本次实验采用差速贴壁法去除成纤维细胞，37℃培养1小时，吸取上清液置于另一孔中继续培养，每隔一小时转一次，转移3~4次，4天后换液，以后每天换液1次，直到增殖达到融合。

大鼠骨骼肌细胞

04 细胞观察及鉴定

1. 差速培养后，细胞24小时后开始贴壁，96小时后完全贴壁，倒置显微镜下每天观察细胞生长及形态特征，传代培养纯化至P3代用于后续试验。
2. 采用HE染色和α-actin染色进行骨骼肌细胞鉴定。
3. 结果表明：本实验所用的消化液以及差速贴壁法可分离培养出纯度高、活力旺盛的骨骼肌细胞。

05 注意事项

1. 消化液的制备及消化时间

合适的消化液以及消化时间的把握，是实验取材的关键。合适的消化液利于骨骼肌细胞从基膜中释放出来。作用时间不足则获得细胞较少，作用时间过长则可致细胞受损、生长状态不良。

2. 肌肉组织要尽可能剔除表面的膜和脂肪组织

肌肉组织表面的膜和脂肪组织去除利于后续细胞的纯化，减少传代次数，获得纯度高的骨骼肌细胞。

3. 纤维细胞的去除

本实验采用差速贴壁法去除成纤维细胞，37 ℃培养 1 小时后移至另一孔进行培养，转移两次，有效去除骨骼肌细胞中的成纤维细胞。

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