概述

        黑色素细胞来源于神经嵴的树突细胞，是表皮细胞的主要细胞成分之一。黑色素细胞培养对研究和治疗色素异常性皮肤病有重要意义。由于其数量在正常人体表皮中所占的比例仅为3%~7%，因此，在体外培养中获得纯度较高的黑色素细胞的关键是在分离和培养过程中去除混杂的角质细胞和成纤维细胞，
用品

        (1)临床活检获取的正常人皮肤组织或新生儿阴茎包皮。

        (2)眼科剪、眼科镊、手术刀、培养皿、吸管。

        (3)D-Hanks溶液、PBS、0.25%胰蛋白酶。

        (4)培养液:DMEM和Ham'sF12各一份混合，添加10%胎牛血清、谷氨酰胺6mmol/L、胰岛素5μg/mL、表皮生长因子5ng/mL、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL、二性霉素0.5 μg/mL、TPA(十四烷左荼酰法佛醋酸酯)10ng/mL。亦可用黑色素细胞培养液，即MCDBI53培养基：MCDBI53为基础，加入2mmol/LCaCl₂、以4:1比例添加 Leibovi L-15、2%胎牛血清、胰岛素5μg/mL，表皮生长因子5ng/mL、TPA 10ng/mL、牛垂体提取液 40 μg/mL。

步骤

        (1)无菌切取皮肤组织，用70%乙醇浸泡30min，用D-Hanks溶液冲洗剪去皮下和脂肪组织。

        (2)剪切成0.5cm²小片，放入含0.25%胰蛋白酶平皿内，使表皮面向上，在4℃冰箱中消化18~24 h。

        (3)弃去消化液，用D-Hanks溶液冲洗。

        (4)当表皮层与真皮层分离时，表皮层为浅棕色，真皮层为白色，观察到标本边缘表皮与真皮分离时将其移入另一10cm塑料平皿，真皮表面向下用5mL含血清完全培养液冲洗，用两个弯镊轻轻地将表皮剥脱，放入含20mL培养液的50mL离心管中，用吸管反复吹打，丢弃真皮。

        (5)室温下，用D-Hanks 溶液离心洗涤分散细胞悬液3次(每次2000r/min，5min)，洗涤时弃去可能含有角质层的上清液。

        (6)细胞沉淀后，用黑色素细胞生长培养基重新悬浮细胞，并进行细胞计数，以2x10⁵/cm²细胞密度接种，于37℃、5%CO₂,条件下培养48~72h。每3d更换1次培养液，若成纤维细胞生长过多，可用含200μg/mL的G418(geneticin)的培养基处理2~3d，抑制成纤维细胞的生长。操作提示

        黑色素细胞培养的难点在于去除混杂的角形成质细胞和成纤维细胞，使培养液中的Ca²⁺浓度降低至0.03mmol/L可防止成纤维细胞的过度生长，且对黑色素细胞的生长无不良影响。

结果及鉴定

        接种后24~48h即可贴壁，一般在培养第2天即可见到黑色素细胞，起初细胞呈梭形，两端各有一个相对称的树枝状突起，随着细胞的增殖，突起将更见明显。培养初期可见混杂生长的角化细胞和成纤维细胞，3周后可获得大量纯化的黑色素细胞。

        黑色素细胞具有产生黑色素的功能，多巴胺反应阳性。