From: Nature Communications，IF=16.6

图2 | 蛋白质组学筛选识别PDZD8–FKBP8蛋白复合体。

a. 使用Pdzd8-3×HA KI小鼠新皮质的免疫沉淀和LC–MS/MS分析方案。使用抗HA抗体从Pdzd8-3×HA小鼠或对照小鼠的新皮质中进行免疫沉淀，然后进行LC–MS/MS分析。

b. 描述Pdzd8-3×HA KI小鼠基因组序列的图。在Pdzd8编码序列的C端敲入3×HA标签序列。

c. 与PDZD8-3×HA结合的蛋白质差异结合的火山图。FKBP8用红色标记。Protrudin和VAPA，以前报道与PDZD8相互作用的蛋白质，用蓝色标记。该图表示三个生物学重复的数据。p值使用未调整的双尾学生t检验计算。

d. 使用内源性PDZD8的邻近标记方案的方案。与PDZD8融合的生物素连接酶TurboID从生物素和ATP生成生物素–5′-AMP。生物素–5′-AMP可以与内源性表达的PDZD8-TurboID附近大约20 nm的蛋白质共价结合。

e. 描述PDZD8-TurboID KI HeLa细胞基因组序列的图。TurboID-P2A-Neor序列在PDZD8编码序列的C端敲入。

f. 在PDZD8-TurboID KI HeLa细胞中用生物素差异生物素化的蛋白质的火山图。FKBP8用红色标记。Protrudin和VAPA，以前报道与PDZD8相互作用的蛋白质，用蓝色标记。火山图表示三个生物学重复。p值使用未调整的双尾学生t检验计算。

g. IP–MS（c）和TurboID-MS（f）中高度富集的蛋白质数量在维恩图中显示。两个蛋白质组中共同发现12种蛋白质。注意，FKBP8是唯一被注释为线粒体定位的蛋白质。

h，i. 使用Pdzd8-3×HA KI小鼠（h）或Pdzd8-Venus KI NIH3T3细胞（i）的内源性FKBP8和内源性PDZD8-3×HA的相互作用分析。从Pdzd8-3×HA KI小鼠的新皮质（h）或Pdzd8-Venus KI NIH3T3细胞（i）中提取的提取物分别用HA或GFP抗体进行免疫沉淀。原始组织提取物（总计）和沉淀物分别用FKBP8、VAPA、MFN2、HA（h）、GFP（i）和β-actin（i）抗体进行免疫印迹分析。数据代表三个独立实验。

图3 | 直接结合伙伴FKBP8是需要PDZD8在线粒体上招募的。

a. SPR测定的传感器图。重组人PDZD8（1, 28–）-FLAG固定在传感器芯片上，注射不同浓度的FKBP8（1–380）-Histag。

b. 将平衡时的SPR响应（Req）与FKBP8浓度作图。将Req与FKBP8浓度的滴定曲线拟合到单价结合模型以确定KD值。

c. 各种结构域删除的PDZD8突变体的示意图。TM跨膜，SMP类似突触小泡蛋白样线粒体脂质结合，C2n C2结构域N端序列，PDZ PDZ结构域，C2c C2结构域C端序列，C1 C1结构域，CC 卷曲螺旋区域。

d. Pdzd8f/f::CreERT2MEFs表达一系列删除突变体PDZD8-3×FLAG，并与HA标记的FKBP8共同处理1 μM 4-羟基他莫昔芬（4-OHT），细胞提取物用抗HA抗体免疫沉淀。用抗HA抗体和抗FLAG抗体进行Western blotting。数据代表三个独立实验。

e. 体外混合重组GST–切割位点–人PDZD8（1, 28–506）–HA和重组人FKBP8（1–380）–Histag的GST拉下测定。仅当与GST-PDZD8（1, 28–506）–HA孵育时，FKBP8–Histag才从GST珠中洗脱。数据代表两个独立实验。

f. 使用相同一组纯化蛋白和抗HA抗体进行的HA拉下测定。与hPDZD8（1, 28–506）–HA孵育时，FKBP8-Histag富集，与阴性对照（缓冲液或含BSA的缓冲液）相比。数据代表两个独立实验。

g. 通过共聚焦显微镜和Nikon空间阵列共聚焦（NSPARC）检测器对Pdzd8-Venus KI NIH3T3细胞敲除内源性FKBP8的免疫荧光分析。细胞转染了对照gRNA（上两行）或针对FKBP8的三个gRNA（下两行），Cas9和转染标记mtagBFP2，并用GFP和Tomm20抗体染色以可视化内源性PDZD8-Venus（绿色）和线粒体外膜（品红色）。比例尺：5 µm（原始）1 µm（放大）。

h. 内源性PDZD8-Venus与线粒体（Tomm20阳性区域）重叠强度百分比的定量。数据以箱形图表示，中心表示中位数，25和75百分位数由箱形图表示。须延伸到最小和最大值。n = 17, 14个对照和FKBP8 KO细胞。使用双侧Mann–Whitney U检验进行统计分析。**p = 0.003。

图4 | PDZD8和FKBP8共同需要形成MERCS。

a. 用慢病毒携带shControl或shFKBP8感染的Pdzd8f/f::CreERT2 MEFs的代表性电子显微图，以及用或不用0.5 µM 4-OHT处理。MERCS（黄色箭头）在对照细胞中比在Pdzd8 cKO、Fkbp8 KD和Pdzd8 cKO + Fkbp8 KD细胞中更频繁观察到。比例尺：200 nm。

b. 通过线粒体周长归一化的MERCS长度的定量。数据以箱形图表示，中心表示中位数，25和75百分位数由箱形图表示。须延伸到最小和最大值。n = 33, 29, 39, 34个细胞来自两个独立实验，分别为对照、Pdzd8 cKO、Fkbp8 KD和Pdzd8 cKO + Fkbp8 KD细胞。使用单因素方差分析和Fisher的LSD检验进行统计分析。****p < 0.0001, ***p = 0.0003。

c. 对应于b的交互图。点显示每种条件的平均值。

d. 双向方差分析测试的结果。交互作用的低（<0.01）变化表明PDZD8和FKBP8共同影响MERCS的面积。

图5 | 内源性PDZD8和FKBP8在线粒体上共定位。

a. PDZD8-Halotag KI HeLa细胞的免疫荧光分析。细胞用200 nM的Janelia Fluor 549处理20小时，然后用FKBP8和Tomm20抗体染色。上图的框选区域在相应的下图中放大显示。箭头指示PDZD8与FKBP8和Tomm20共定位。比例尺，5 μm（原始）或1 μm（放大）。

b. 图a中获得的图像中FKBP8强度在或在线粒体外（off）的比率确定。误差条是两个独立实验的九个细胞的平均值±s.e.m.。三个细胞质区域的平均值用于分析。

c. 使用OpenCV的connected Components With Stats函数，在PDZD8和FKBP8的二值化图像中分割PDZD8和FKBP8的点，然后获得单个点的质心。通过在显示FKBP8质心的图像中使用Tomm20的二值化图像进行掩蔽，定义“在线粒体上”或“在线粒体外”区域的质心。使用Python的random模块在相应区域中打乱FKBP8的像素以获得打乱的FKBP8图像。分别在“在线粒体上”、打乱的“在线粒体上”、“在线粒体外”和打乱的“在线粒体外”图像中创建FKBP8的距离图。然后计算PDZD8点与最近FKBP8的距离对应于图中x轴的每个bin的数量。

d. 为了计算PDZD8和FKBP8在线粒体上的Manders系数，计算了FKBP8存在线粒体区域的PDZD8强度总和除以线粒体上的总PDZD8强度。通过在FKBP8通道内使用Python的random模块打乱线粒体区域内的像素来创建打乱的FKBP8图像。

e. 使用Tomm20和FKBP8的二值化图像定义FKBP8存在或不存在的线粒体区域作为ROI，然后计算ROIs的PDZD8强度总和除以ROIs的面积。图S7d，e中的图像分析使用与图5d，e相同的方法进行。在图6a，b中，使用YFP-ActA信号作为指导，手动定义ROIs为细胞质区域。通过Otsu方法对YFP-ActA的二值化图像定义线粒体区域，然后计算线粒体上的PDZD8强度百分比（Manders系数，M1）。

图6 | 过表达线粒体FKBP8招募内源性PDZD8到线粒体附近。

a. 过表达HA-FKBP8N403K的PDZD8-Halotag KI HeLa细胞的免疫荧光分析。转染对照质粒（上两行）或编码HA-FKBP8N403K的质粒（下两行），以及线粒体标记YFP-ActA的细胞，用200 nM的JF549处理20小时，然后固定细胞用共聚焦显微镜和Nikon空间阵列共聚焦（NSPARC）检测器观察。比例尺：5 µm（上图），1 µm（放大图）。

b. 内源性PDZD8-Halotag与线粒体（YFP-ActA阳性区域）重叠强度百分比的定量。数据以箱形图表示，中心表示中位数，25和75百分位数由箱形图表示。须延伸到最小和最大值。n = 78, 48个对照和FKBP8N403K过表达细胞来自两个独立实验。使用双侧学生t检验进行统计分析。***p = 0.0007。

c–e. 在PDZD8-HaloTag KI HeLa细胞中进行相关光和电子显微镜（CLEM）分析。过表达Venus-FKBP8N403K或YFP-ActA（作为对照）的细胞用200 nM的JF549处理20小时，然后用共聚焦显微镜观察固定细胞。然后，创建50 nm厚的超薄切片，并在场发射扫描电子显微镜（FE–SEM）中观察。电子显微图的连续8切片对应于荧光图像的一个光学切片。在电子显微图中分割和三维（3D）重建线粒体和距离线粒体25 nm内的内质网（MERCS）如c所示。从电子显微图（显示为“EM”）进行的3D重建与荧光图像（显示为“LM”）如d所示合并。电子显微图中线粒体和MERCS的z投影与荧光图像如e所示重叠。箭头指示定位于MERCS的PDZD8点。

图7 | 过表达线粒体FKBP8N403K缩小MAM和线粒体之间的距离。

a. FKBP8N403K过表达增加了PDZD8-Venus点的强度和丰度。在低温下，NIH3T3细胞在绿色通道中的自发荧光很强，因此在对照细胞中存在点。Venus荧光团也在红色通道中发射光。图像代表对照和FKBP8N403K OE的两个堆栈（视场：638.9 µm2）。

b–e 对于冷冻电子断层扫描（cryo-ET）分析，使用mScarlet-FKBP8N403K过表达（OE）来增加在冷冻FIB铣削的薄片中捕获的线粒体和线粒体相关膜（MAM）之间的关联数量。显示目标细胞在Cryo-FIB铣削前的SEM图像（b）。冷冻荧光成像证实目标细胞中存在mScarlet-FKBP8N403K。注意，冷冻荧光图像和冷冻TEM之间的明显不匹配是由于包括自发荧光、分辨率差异、注册误差、成像平面中的扭曲和冰晶污染等因素造成的（c）。使用薄片的中分辨率TEM拼接图，针对具有MAM的线粒体进行高分辨率倾斜系列采集（d）。对于OE条件，获得了80个包含MAM的断层图（其中20个完全分割和标记），对于对照条件，获得了10个包含MAM的断层图（其中6个完全分割和标记）。显示OE条件的两个代表性断层图对应于面板（d）中的箭头（e）。图像b代表超过35个细胞。图像c代表13个薄片。FLM：荧光光显微镜。f 使用表面形态测量分析计算MAM-线粒体外膜（OMM）距离。距离显示为热图。g 面积加权MAM–OMM距离直方图的总体分析显示，在过表达条件下与对照相比距离更小。

图8 | 体积EM分析揭示PDZD8通过抑制FKBP8促进线粒体复杂性。

a. 通过体积EM进行线粒体形态分析的示意图。通过FE–SEM获取连续切片的串行电子显微图。在裁剪体积后，使用AI辅助管道半自动提取体积中的线粒体。

b. 计算MCI（线粒体复杂性指数）的公式42。MCI计算为SA3/(16π2V2)，其中SA是表面积，V是每个线粒体的体积（见方法部分的详细信息）。

c. PDZD8 cKO细胞的代表性3D重建，这些细胞来自用携带shControl或shFKBP8的慢病毒感染并用或不用0.5 µM 4-OHT处理的Pdzd8f/f::CreERT2 MEFs。比例尺：1 µm。d. MCI（线粒体复杂性指数）42的定量。数据以箱形图表示，中心表示中位数，25和75百分位数由箱形图表示。须延伸到最小和最大值。n = 63, 90, 54, 和 52个线粒体来自5, 5, 5, 和 4个细胞，分别为对照、Pdzd8 cKO、Fkbp8 KD和Pdzd8 cKO + Fkbp8 KD条件。使用单因素方差分析和Fisher的LSD检验进行统计分析。****p < 0.0001, ***p = 0.0006, *p = 0.033。