创新疗法！脂肪干细胞与多西环素水凝胶加速感染烧伤创面愈合！

From: Chemical Engineering Journal，IF=13.3。

摘要

烧伤创面因其复杂的病理生理学和感染风险而给临床治疗带来了重大挑战。基于脂肪来源干细胞（ADSC）的疗法在治疗烧伤创面方面展现出巨大潜力，这主要得益于ADSC分泌的生长因子。然而，ADSC分泌的生长因子数量有限。近期，成纤维细胞生长因子21（FGF21）在伤口愈合方面表现出卓越的效果，但其对感染性伤口的影响仍不明确。

在此研究中，我们将过表达FGF21的工程化ADSCs（ADSCFGF21）和多西环素（DOX）封装在由甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）和甲基丙烯酰化明胶（GelMA）交联形成的水凝胶网络中，制备出一种HG水凝胶。HG/DOX/ADSCFGF21水凝胶敷料展现出良好的生物相容性和可注射性。此外，它对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）具有强大的杀菌效果。体外研究表明，HG/DOX/ADSCFGF21水凝胶显著增强了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖和管腔形成，促进了M2型巨噬细胞的极化，并降低了细胞内的活性氧（ROS）水平。特别是，HG/DOX/ADSCFGF21水凝胶通过减轻伤口处的ROS并增加M2型巨噬细胞的比例，改善了MRSA感染的烧伤创面愈合。RNA测序揭示，HG/DOX/ADSCFGF21水凝胶激活了MAPK和SIRT1信号通路，这可能有助于新生血管形成和胶原蛋白沉积。本研究表明，HG/DOX/ADSCFGF21水凝胶有望成为治疗感染性烧伤创面的有力候选材料。

​内容总结

在本研究中，通过慢病毒介导的基因质粒转染生成了ADSCFGF21。ADSCs是从一位健康成年供体的腹部脂肪组织中提取的。为了建立稳定过表达FGF21的ADSCs，我们使用pLVX-EnCMV-HA-MCS-PGK-Puro骨架构建了慢病毒载体。通过同源重组将FGF21基因克隆到慢病毒质粒中，促进其稳定整合到宿主基因组中。我们开发了一种基于多西环素（DOX）和过表达FGF21的ADSCs（ADSCFGF21）的协同作用的水凝胶敷料，用于感染性烧伤创面。这种可注射水凝胶展现出良好的组织粘附性、优异的生物相容性和强大的抗菌能力，同时促进止血、清除活性氧（ROS）和血管生成。此外，1HG/DOX/ADSCFGF21复合水凝胶显著促进了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的血管生成和成纤维细胞的迁移。

烧伤及传统治疗方法：

烧伤是日常生产和生活中最常见的意外伤害之一，对患者健康和心理社会功能产生严重影响。

传统治疗方法（如皮肤移植和先进敷料）在促进组织完全再生方面效果有限，且难以恢复皮肤的全部功能和美观性。

干细胞疗法及脂肪来源干细胞（ADSCs）：

干细胞疗法作为一种新兴的治疗方法受到广泛关注，尤其是脂肪来源干细胞（ADSCs）。

ADSCs可通过加速再上皮化、成纤维细胞激活、迁移、增殖和胶原合成来调节皮肤伤口愈合。

ADSCs具有易于分离、来源丰富且伦理问题少等优点，使其在临床应用中极具吸引力。

成纤维细胞生长因子21（FGF21）：

FGF21是一种关键的组织修复和再生调节因子，可促进角质形成细胞迁移和分化，增加成纤维细胞迁移，并调节巨噬细胞极化，从而减轻慢性炎症损伤。

然而，FGF21本身稳定性差、清除速度快，需要多次给药以维持有效浓度，这降低了患者的依从性，增加了治疗成本。

干细胞治疗的挑战：

干细胞治疗面临诸多挑战，如旁分泌生长因子浓度低、局部注射时细胞活性差、病理性烧伤伤口环境中细胞凋亡率高等问题，限制了其在烧伤治疗中的应用。

基因修饰ADSCs和水凝胶的结合：

提出使用过表达FGF21的基因修饰ADSCs（ADSCFGF21）与原位水凝胶（由交联的甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）和甲基丙烯酰化明胶（GelMA）组成）相结合的方法。

这种设计可结合ADSCs的再生能力和FGF21的强效作用，同时通过水凝胶延长ADSCFGF21的活性和作用时间。

水凝胶的特性：

水凝胶可作为物理屏障，保护伤口免受外界污染，同时为伤口愈合创造理想的湿润环境。

HAMA和GelMA的主要成分透明质酸（HA）和明胶（GT）具有促进细胞增殖、迁移、血管生成、神经再生以及减轻瘢痕形成等作用。

HA和GT还具有抗炎和免疫调节功能，可多层面调节伤口微环境。

抗菌活性的引入：

烧伤伤口易感染，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等病原微生物感染，会显著延缓伤口愈合。

为解决抗菌问题，研究中引入了多西环素（DOX），它是一种广谱抗菌剂，对细胞活性无影响，且具有抗炎作用。

多功能复合水凝胶递送系统：

开发了一种基于HAMA和GelMA的多功能复合水凝胶递送系统，将过表达FGF21的干细胞（ADSCFGF21）包裹在水凝胶（HAMA/GelMA/DOX，HG/DOX）中。

该水凝胶具有良好的可注射性、生物粘附性和生物相容性。

抗菌和愈合效果：

将DOX载入水凝胶可有效将抗生素递送至伤口部位并实现持续释放，对抑制耐药细菌感染至关重要。

成功包裹ADSCFGF21可有效减少伤口活性氧（ROS），促进巨噬细胞从M1向M2极化，减轻炎症反应，增强血管生成，加速感染伤口愈合。

研究结果表明，HG/DOX/ADSCFGF21水凝胶是一种有前景的感染烧伤伤口敷料。

这种研究设计通过结合基因修饰干细胞和多功能水凝胶，为烧伤治疗提供了一种创新且有效的解决方案，有望改善感染烧伤伤口的愈合效果。

图文摘要

图 1. 载有ADSCFGF21和DOX的可注射粘附性水凝胶的设计与应用示意图。

(A) 载有ADSCFGF21和DOX的水凝胶（HG/DOX/ADSCFGF21）的示意图。

(B) 水凝胶的可注射性和抗炎作用机制示意图。

(C) 水凝胶在感染烧伤创面中的应用及HG/DOX/ADSCFGF21水凝胶在调节抗菌活性、粘附性和创面微环境中的机制。

图 2. ADSCFGF21的制备与表征。

(A)ADSCFGF21制备示意图。

(B) ADSCs和ADSCFGF21中FGF21表达的Western blot分析（n = 3）。

(C) ADSCs和ADSCFGF21中FGF21的定量分析（n = 3，*** P < 0.001）。

(D) 和 (E) ADSCs和ADSCFGF21在光学显微镜和荧光显微镜下的图像。

(F) 流式细胞术分析ADSCFGF21的CD29、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD11b和CD19标记。

(G) 和 (H) ADSCs和ADSCFGF21的油红O和茜素红S染色图像，显示脂肪生成和成骨能力。

图 3. 水凝胶的表征。

(A) GelMA的1H NMR谱图。

(B) 水凝胶的流变性质。

(C) 不同水凝胶的膨胀性质（n = 3）。

(D) 水凝胶的SEM图像。

(E) 水凝胶在猪皮上的粘附性质测试。

(F) 和 (G) 水凝胶的可注射性。

(H) 水凝胶对人皮肤的粘附性。

(I) 猪皮粘附和粘附强度数据的示意图（n = 8）。

(J) 水凝胶对塑料和人皮肤在水环境中的粘附性。

(K) 水凝胶对Balb/c小鼠的心脏、肝脏、脾脏和胃的粘附性。

图 4. 水凝胶的相容性测试。

(A) 和 (B) Z轴扫描和3D重建的共聚焦激光扫描显微镜图像显示ADSCs和ADSCFGF21在0.5HG、1HG和2HG水凝胶中封装5天后的图像。

(C) ADSCFGF21在0.5HG、1HG、2HG和1HG/DOX水凝胶中封装3、5和7天后的细胞活性（以在组织培养瓶中生长的细胞作为对照组，n = 3）。

(D) ADSC和ADSCFGF21在1HG/DOX水凝胶中封装3、5和7天后的细胞活性（以在组织培养瓶中生长的细胞作为对照组，n = 3）。

(E) 不同水凝胶的上清液宏观图像和溶血比率（n = 3）。

(F) 与水凝胶共培养24小时后的HUVECs的活/死染色。

图 5. 水凝胶对HUVECs和HFBs的体外生物学效应。

(A) 用DCFH-DA探针标记的ROS阳性HUVECs的荧光图像。

(B) 与水凝胶共培养24小时后的HUVECs的管状形成实验图像。

(C) 与水凝胶共培养24小时后的HFB的迁移图像。

(D) 共培养24小时后的极化巨噬细胞的荧光图像。

(E) ROS荧光的定量分析（n = 3）。

(F) HUVECs总管长度的统计（n = 3）。

(G) 迁移面积的统计（n = 3）。

(H) 和 (I) iNOS和CD206的荧光强度（n = 3）。

图 6. 水凝胶的抗菌活性。

(A) 水凝胶抗生素释放和杀菌作用的示意图。

(B) 1HG/DOX和1HG/DOX/ADSCFGF21水凝胶随时间释放的DOX（n = 3）。

(C) 与MRSA共培养后的细菌悬浮液的OD值（n = 3）。

(D) 与水凝胶共培养后的MRSA菌落图像。

(E) 抗菌效果的定量分析（n = 3）。

(F) 与MRSA接触后的第一天至第七天的抑制区图像。

(G) MRSA抑制区直径的定量分析（n = 3）。

图 7. 1HG/DOX/ADSCFGF21水凝胶的止血能力。

(A) 大鼠肝脏出血模型示意图。

(B) 水凝胶处理的大鼠肝脏的止血图像。

(C) 兔股动脉出血模型及止血示意图和图像。

(D) 水凝胶接触和覆盖兔股动脉后的止血图像。

(E) 水凝胶触发的凝血机制示意图。

(F) 大鼠肝脏（n = 5）和兔股动脉出血模型（n = 3）的失血量定量分析。

图 8. 水凝胶治疗感染烧伤创面的体内评估。

(A) 感染烧伤创面模型和水凝胶处理过程示意图。

(B) 不同水凝胶处理的感染创面的代表性图像。

(C) 第0、3、7和14天的创面收缩痕迹。

(D) 对照组、1HG、1HG/DOX和1HG/DOX/ADSCFGF21组的创面大小定量分析（n = 8）。

(E) 第3天的细菌培养平板图像。

(F) 细菌菌落的定量分析（n = 5）。

(G) 和 (H) 第14天从小鼠创面组织中获得的H&E和Masson染色的代表性图像。

图 9. 创面组织的组织学分析。

(A) 使用DHE探针在第3天检测创面区域的ROS水平（n = 3）。

(B) CD86和CD206的免疫荧光图像；CD31和TNF-α的免疫荧光图像。

(E) ROS强度的定量分析。

(F) M2/M1巨噬细胞比率的定量分析。

(G) 血管数量的定量分析。

(H) TNF-α荧光强度的定量分析（n = 5）。

图 10. 使用1HG/DOX/ADSCFGF21水凝胶处理的感染性创伤组织的RNA-seq分析。

（A）对照组和1HG/DOX/ADSCFGF21组转录组数据的主成分分析（PCA）。每个点代表一个样本。

（B）火山图显示上调（515个）和下调（475个）的基因。

（C）显著上调和下调的基因热图，涉及炎症、氧化应激、组织再生、神经再生和蛋白水解，经过1HG/DOX/ADSCFGF21处理后（P < 0.05，倍数变化 ≥ 1.5）。

（D）KEGG通路分析和（E）基因本体（GO）富集分析差异表达基因。

（F）和（G）感染性创伤组织中差异表达蛋白的Western blot图像及定量分析（n = 3）。

（H）1HG/DOX/ADSCFGF21水凝胶促进感染性烧伤创伤愈合的机制示意图。

参考文献：

Gu Y, Liang Z, Wang Y, et al. Engineered ADSCs and doxycycline encapsulated antibacterial, immunomodulatory and proangiogenic hydrogels for infected burn wound healing[J]. Chemical Engineering Journal, 2025, 503: 158478.