外泌体是什么？

外泌体（Exosome）是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径为40～100 nm，仅相当于人类头发直径的百万分之一，存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。

外泌体虽然体积微小，但其在各类体液中的存在却并非偶然。这些细胞分泌的小小膜泡，携带着超出我们想象的复杂信息。经过深入研究，科学家们已经发现，外泌体能够承载4563种蛋白质、1639种mRNA、764种miRNA、194种脂类分子，甚至包括反映细胞起源的代谢产物。这些发现让外泌体的应用前景变得愈加广阔。

自从外泌体被首次发现以来，它就迅速吸引了越来越多的关注。外泌体不仅能够在相邻细胞之间传递信息，它还能够跨越远距离将蛋白质和遗传物质传递给目标细胞。因此，许多生物技术公司看中其潜力，希望通过外泌体将治疗药物精准递送到难以触及的细胞，尤其是携带多种分子（如核酸）的药物。

外泌体的独特优势在于能够轻松穿越细胞膜，并且具有较低的免疫原性，这使得它在基因治疗、抗肿瘤药物的体内运输等领域具有显著的潜力。

01 外泌体样本制备原则

1. 代表性原则

样本的代表性直接关系到实验结果的科学性，因此在选择取样方案时，应根据实验目的进行慎重设计。实验组和对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面要尽量一致，以确保实验结果的可靠性。

2. 准确性原则

必须准确记录代表性样本的各种特征数据，并按照要求进行采集、制备、保存及运输。在这些过程中，应严格遵循低温和快速处理的标准，以保证实验和数据处理能够与实验设计一致，确保其准确性。

3. 迅速性原则

样本质量是实验结果的关键因素，因此在样本采集、制备、存储及运输的每个环节，都应尽量加速操作，缩短从样本采集到实验实施的时间，以避免样本质量的变化。

4. 低温原则

取样后的样本应尽快存放在干冰或-80℃的冰箱中，且在实验前始终保持在-70℃以下，以避免外泌体降解，确保样本的稳定性。

02 外泌体样本处理方法

1. 贴壁/悬浮细胞

细胞上清的处理

（1）贴壁细胞培养诱导完成后，先去除培养液；

（2）加入适量的PBS缓冲液冲洗一次，确保彻底去除FBS；

（3）按每10cm培养皿（约107个细胞）添加10mL无血清培养基，培养至少48小时，确保细胞融合率达到70%以上；

（4）48小时后，收集细胞上清，使用3000×g离心15分钟，去除细胞及细胞碎片；

（5）将上清液存放在-80℃冰箱中保存。

注意事项

（1）换无血清培养基时，细胞密度应明显增加（例如从60%-70%增长至90%-95%）。若细胞未显著增殖，则不宜收集样本。避免细胞过度生长导致凋亡，因细胞凋亡会降解外泌体。

（2）收集上清后应尽快离心，以去除细胞及碎片，并将上清液储存于-80℃，以避免外泌体降解。

（3）使用无血清替代培养基时，应选用能够正常维持细胞生长的培养基，而非普通基础培养基，如DMEM或1640。

2. 血液样本

血液样本可用于提取外泌体，血清和血浆均可正常提取，但全血样本则无法提取外泌体，因此必须预先分离血清或血浆。以下为不同血液样本的定义：

全血：通过抗凝采血管采集的未经处理的血液。

血浆：抗凝处理的全血经过低速离心后的上清液，呈淡黄色。

血清：不经抗凝处理的全血，允许其自行凝固后，再通过低速离心获得的上清液，同样呈淡黄色。

全血经过长时间放置，或通过冷冻，或高速离心后，会发生溶血，此时无法提取外泌体。所以，一定要提前做好血清或血浆的分离，并且采血后应尽快进行分离，期间不能经过冷冻，离心时转速不能太高，离心后取上清即可。

血液样本处理流程：

（1）采血时间通常为早晨或上午；

血浆：收集2mL抗凝全血，迅速涡旋或用移液器混匀；

血清：收集2mL不含抗凝剂的全血，加入离心管中，待血液凝固后进行离心；

（2）在1小时（室温下）或2小时（4℃条件下）内进行以下操作：4℃，1900g（1568rpm）离心10分钟；

（3）吸取约1mL上清液，转入新的1.5mL离心管，16,000g（13,200rpm），4℃，离心10分钟；小心吸取上清液并转移至新的离心管；

（4）样本放入-80℃冰箱保存；

（5）填写样本登记单，记录样本名称、类型、编号、取样日期和处理过程等信息。

3. 组织液

尿液

（1）收集20mL新鲜尿液，避免细菌污染；

（2）以3000×g离心15分钟，去除细胞或细胞碎片；

（3）样本放入-80℃冰箱保存；

（4）填写样本登记单，记录样本名称、类型、编号、取样日期和处理过程等信息。

脑脊液

（1）收集10mL脑脊液，避免血液污染；

（2）以3000×g离心15分钟，去除细胞及细胞碎片；

（3）样本放入-80℃冰箱保存；

（4）填写样本登记单，记录样本名称、类型、编号、取样日期和处理过程等信息。

4. 外泌体

（1）收集细胞上清或组织液10mL（血清1mL），提取外泌体后，用100μL至500μL的缓冲液重悬沉淀（根据下游分析选择相应的缓冲液，如蛋白分析使用蛋白裂解液，RNA分析使用TriZol裂解液）；

（2）测量浓度，蛋白浓度应≥1μg/μL，RNA浓度应≥50ng/μL；

（3）将样本存放于-80℃冰箱中保存。

03 样本包装注意事项

1. 使用油性记号笔在铝箔或冷冻保存管表面标明样本编号和类型，避免被乙醇等有机溶剂擦掉；
2. 样本应包裹在铝箔或冷冻保存管内，避免直接使用纱布或纸张包裹；
3. 标签纸应贴在样本袋绳上，而非容器表面，避免标签脱落造成混乱；
4. 填写《样本登记单》时，详细记录样本类型、处理方法、存储条件及存储时间等信息，便于实验方案的制定。

04 样本储存与运输

1. 冷冻储存

（1）样本采集后，立即将其放入优质冻存管中，拧紧后存储于-80℃冰箱。

（2） 细胞上清在-80℃储存，避免在-20℃存放过长时间。

（3）血液样本建议使用PAXgene管（BD）保存。

（4）RNA/蛋白样本应存储于-80℃冰箱。

2. 样本运输

（1）干冰运输：使用壁厚良好的泡沫箱，并确保冻存管正确放置，干冰埋入后密封好标明轻取轻放提示。运输时，要求48小时内送达。24小时到达的，干冰数量不得低于5公斤；48小时到达的，干冰数量不得低于8公斤。夏季适当增加干冰（1.5 倍）。超过48小时到达的，建议不要用此法运输。 运输时可在干冰上再放一排冰袋。

（2）冰袋运输：在TRIzol或WB裂解液中保存的外泌体，或新鲜尿液和组织液样本，如果能保证在24h内送达，可以使用冰袋运输。

05 注意事项

1. 样品登记表

所有样本均应标明准确的样本编号，同时配有一张样本登记表，写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。

2. 提取外泌体的得率：

处于不同发育阶段以及不同生长条件的样本中所含有的外泌体的量不同，在某些实验条件下或某些病变部位获得的样本中外泌体的量可能与常规相应样本有显著的差异；

储存条件以及储存时间影响外泌体得率，一般来说从新鲜的样本中总是能够得到预期的外泌体产量，未保存在-80℃或-20℃冰箱中的非新鲜样本不可靠。保存在-80℃冰箱中的样本，如果储存时间过长，外泌体产量也会显著降低。因此，实验中样本需要的量应以抽提结果为准。

3. 关于备份

为确保实验的顺利，建议取样时备份。 备份又分为两种，一种为严格备份，即：样本取下后一分为二，这样的两份样本基本上具备同性质。另一种为非严格备份，即生物学重复的样本，这样的备份样本同质性要较前者差。