1. 抗原抗体反应的基本特点

（1）抗原抗体结合具有特异性 抗原与抗体的结合具有高度特异性，即一种抗原分子只能与由它刺激所产生的抗体结合。抗原的特异性取决于抗原决定簇的数目、性质和空间构型，而抗体的特异性取决于抗体IgFab段可变区与相应抗原决定簇的结合能力。抗原与抗体不是通过共价键结合，而是通过很弱的短距引力结合，如范德华引力、静电引力、氢键和疏水性作用等。通常当pH值和离子强度在生理条件下时，这些引力是最大的。pH值低于4.0或高于10.5时，这些引力非常弱，以至抗原抗体复合物解离。

（2）抗原与抗体的结合是可逆的化学反应 抗原与抗体的结合有高度特异性，这种结合虽具有相当的稳定性，但为可逆反应。抗原与抗体为非共价键结合，不形成稳定的共价键，因此在一定的条件下会解离。抗原抗体反应实质上是一个不断结合与不断解离的平衡过程，所以通常在标记完成后，若不能尽快进行检测，建议用适当的固定液进行固定，如4%多聚甲醛溶液。

2.  抗原抗体反应的影响因素

（1）电解质 抗原与抗体一般为蛋白质，它们在溶液中都具有胶体的性质，当溶液的pH值大于它们的等电点时（例如在中性和弱碱性的水溶液中），它们大多表现为亲水性，且带有一定的负电荷。抗原和特异性抗体有相对应的极性基团，两者的特异性结合也就是这些极性基团的相互吸引。抗原与抗体结合后就由亲水性变为疏水性，此时易受到电解质的影响。因此，通常应用0.85%的生理盐水和pH值为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液作为抗原、抗体的稀释液，以维持适当的电解质浓度。

（2）反应温度与时间 当抗原与抗体在较高温度中反应时，由于抗原、抗体碰撞的机会增多，其反应速度快。但温度过高（56℃以上）时，抗原或抗体将变性或被破坏。大多数实验室在室温环境（25℃左右）中进行免疫荧光染色，适当振摇，可加快两者的反应速度；也有学者认为在4℃冰浴下反应更好。反应时间也是抗原抗体反应必要的条件之一，时间越短，结合越不完全。反应时间一般以30~60min为宜。但值得注意的是，对于采用全血法（用全血标本进行标记，再破坏红细胞）进行检测的，由于全血标本中含有补体系统，抗原抗体反应会激活补体系统，导致阳性细胞溶解而影响检测结果，因而不能在37℃的恒温水浴中或室温环境中进行反应，而宜在4℃冰箱中反应，且反应时间不能太长，一般为30min左右。时间太长（超过1h），也会引起阳性细胞溶解，故实验者一定要严格控制反应时间。

荧光抗体选择与组合的好坏直接影响流式结果的准确性。其选择与组合的总原则为根据机型选配合适的抗体，抗体的选择宜符合“高低搭配”原则。其原则有以下几点。

1. 尽量使用直接标记抗体

直接标记抗体是用荧光素标记的单克隆抗体或多克隆抗体，一步染色，操作方便，影响因素少，结果准确。

2. 注意流式抗体的应用级别

美国食品药品监督管理局（FDA）将流式试剂分为IVD（classI in vitro diagnostic product，I类体外诊断试剂）， ASR（analyte specific reagent，分析物特异性试剂）和RUO（research use only，仅用于研究）试剂三类。其中, IVD和ASR均可用于体外临床诊断，而RUO试剂只能用于科学研究，不能用于临床诊断。在我国，用于体外诊断的试剂还必须取得国家食品药品监督管理总局（SFDA）认证。

3. 抗体滴度或标记量的选择

建议根据抗体使用说明书使用抗体标记量或浓度，也可在正式实验前，根据信噪比来确定其最合适的滴度。首先将细胞的浓度固定（一般为1x10^５个/管），根据抗体使用说明书建议的使用浓度，选择高、中、低浓度和同型抗体对照，在相同的实验条件下进行免疫染色后检测，显示每一种滴度与同型抗体对照的直方图，统计阳性细胞与对照细胞的平均荧光强度，并计算特异性荧光信号（signal）与非特异性荧光信号（noise）的比值，即信噪比（signal-to-noise ratio， S/N值）。S/N值越大，表示阳性细胞与对照细胞的荧光峰分离越好，S/N值>3属于可接受范围。

在进行单色或多色标记时，应注意抗体的稀释度。如3种抗体单独使用时的最佳用量是20μL，而进行3色标记时，若各加20μL，则总量为60μL。对于每一种抗体来说，其浓度因为稀释而变成原来的1/3，不再是最佳用量。因此进行多色标记时应该注意控制稀释度，即各抗体用量与总反应体系之间的比例，或适当延长反应时间。

提醒：在检测流式标本时，我们经常发现如下问题：①为节省荧光抗体，不经过预实验，就按抗体说明书减半量甚至更多进行标记；②不进行细胞计数，完全凭感觉进行标记。这样操作会直接影响实验结果，因为细胞数量和抗体的标记量就像一个跷跷板的两头，当细胞数量增加、抗体量不变或细胞数量不变、抗体量不足或过量时，荧光抗体分布到每个阳性细胞上的量减少或背景过强，导致分群不明显（图1）。因此，不建议使用抗体减半量甚至更多进行标记，除非进行过预实验，并要注意进行细胞计数，使每次实验的细胞数量基本一致。

图1 荧光抗体过多或过少影响阴、阳性细胞分群

注：抗体用量为0.1~0.3 pg时，阴、阳性细胞分群明显；抗体不足或过量时，荧光抗体分布到每个阳性细胞上的量过少或背景过强，导致分群不明显。

4. 根据流式细胞仪的类型及荧光素的荧光光谱选择荧光抗体

不同类型的流式细胞仪所配备的激光器种类、数量不同，其激发波长不同，所使用的光学滤片也会有差异（图2）。如：FACSCalibur配有488nm和633nm的双激光器，可提供双波长激发光；BD LSR II可有355 nm、405 nm、488 nm和633 nm四种激光器选择，可进行10色以上的多色荧光分析。