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送样要求-不同玻片染色或标记前处理流程

更新时间: 2025-01-16 17:27

一、染色前准备

1. 石蜡切片处理

1.1 脱蜡至水 对需要检测的切片进行标记后，依次将切片浸入环保型脱蜡液I、II、III各10分钟，接着在无水乙醇I和II中各浸泡5分钟，随后在85%酒精中5分钟，在75%酒精中5分钟，最后用纯水彻底清洗。为确保酒精清除干净，建议多次更换纯水。在低温环境下，为确保脱蜡效果，可将第一缸环保型脱蜡液加热至65℃进行脱蜡。

1.2 组化笔画圈（可选） 若试剂需要滴染，清洗后的切片在稍沥干水分后，用组化笔沿组织边缘画圈，通常距离组织约3mm，待圈干后再次用纯水清洗。

1.3 染色 完成清洗的切片根据染色项目继续进行后续染色实验。

2. 冰冻切片处理

2.1 复温至水（不进行后固定） 从低温冰箱取出切片后，室温复温10-15分钟，标记后放入纯水中浸泡10-20分钟，以彻底去除切片上的OCT，否则可能影响后续画圈效果及染色均匀性。

2.2 后固定（可选） 若需后固定，标记后将切片放入固定液中，通常使用通用型组织固定液（中性），室温固定20分钟，然后用纯水或PBS清洗三次，每次5分钟。

2.3 组化笔画圈（可选） 与石蜡切片相同，若试剂需要滴染，清洗后的切片在稍沥干水分后，用组化笔沿组织边缘画圈，待圈干后再次用纯水清洗。

2.4 染色 完成清洗的切片根据染色项目继续进行后续染色实验。

3. 细胞爬片处理

3.1 润洗 去除培养皿中的试剂后，用PBS轻轻润洗两次。

3.2 后固定 加入后固定液进行固定，通常使用通用型组织固定液（中性），室温固定20分钟，然后用纯水或PBS清洗三次，每次5分钟。

3.3 染色 完成清洗的细胞爬片根据染色项目继续进行后续染色实验。

4. 细胞悬液涂片处理

4.1 涂片前固定 细胞悬浮液离心后去除上清，加入固定液重悬细胞，通常使用通用型组织固定液（中性），室温固定20分钟。

4.2 清洗 固定后的细胞用PBS离心清洗三次，每次5分钟。

4.3 涂片 清洗后的细胞悬浮液离心后去除上清，根据细胞含量加入50-200ul干净的PBS重悬，取10ul左右的细胞悬浮液滴于载玻片上，用移液枪吸头晕开或用盖玻片划开，涂完后的载玻片晾干，可自然晾干或用电风扇吹干。

4.4 画圈 晾干后的涂片，用组化笔在周围画圈，圈干后用纯水或PBS润洗。

4.5 染色 完成清洗的细胞涂片根据染色项目继续进行后续染色实验。

二、标记前准备

1. 石蜡切片处理

1.1 脱蜡至水 与染色前处理相同。

1.2 抗原修复 根据组织类型及抗体种类，选择相应的抗原修复液及修复方式进行抗原修复。通常采用高温修复方式，如抗原修复仪、微波、高压等。若组织不能承受高温，可选择酶修复方式。

1.3 画圈 自然冷却后用PBS清洗切片，用组化笔沿组织边缘画圈，待圈干后再次用纯水或PBS清洗。

1.4 标记 进行后续IHC/IF/TSA/FISH等标记实验。

2. 冰冻切片处理

2.1 复温 从低温冰箱取出切片后，室温复温10-15分钟，然后标记。

2.2 后固定 根据实验要求，用不同固定液进行后固定，通常使用通用型组织固定液（中性），室温固定20分钟。

2.3 清洗 固定后，用PBS清洗三次，每次5分钟。

2.4 修复消化（可选） 与石蜡切片相同，选择相应的抗原修复液及修复方式进行抗原修复。若样本带有自发光，避免高温修复，以免自发光淬灭。

2.5 画圈 自然冷却后用PBS清洗切片，用组化笔沿组织边缘画圈，待圈干后再次用纯水或PBS清洗。

2.6 标记 进行后续常规IHC/IF/TSA/FISH等标记实验。

3. 细胞爬片处理

3.1 润洗 去除培养皿中的试剂后，用PBS轻轻润洗两次。

3.2 后固定 加入后固定液进行固定，通常使用通用型组织固定液（中性），室温固定20分钟，然后用纯水或PBS清洗三次，每次5分钟。

3.3 画圈 自然冷却后用PBS漂洗，用组化笔在爬片边缘画圈，待圈干后再次用纯水或PBS清洗。

3.4 通透（可选） 加入破膜液破膜，通常室温破膜15-20分钟，破膜后PBS清洗三次，每次5分钟。

3.5 标记 清洗后，进行后续IHC/IF/TSA/FISH等标记实验。

4. 细胞悬液涂片处理

4.1 涂片前固定 与染色前处理相同。

4.2 清洗 与染色前处理相同。

4.3 涂片 与染色前处理相同。

4.4 后固定 晾干后的细胞涂片，根据前固定液类型，再进行后固定，通常使用通用型组织固定液（中性），室温固定20分钟，以防止细胞掉片。

4.5 画圈 固定后的涂片，PBS清洗三次，每次5分钟。用组化笔在细胞涂片周围画圈，圈干后用纯水或PBS润洗。

4.6 破膜 PBS清洗三次，每次5分钟，在圈内加入破膜液破膜，通常室温破膜15-20分钟，破膜后PBS清洗三次，每次5分钟。

4.7 标记 清洗后，进行后续IHC/IF/TSA/FISH等标记实验。

三、细胞爬片制备流程（以6孔板为例）

1. 细胞复苏

1.1 预热 水浴锅预热至37℃。

1.2 灭菌 超净工作台紫外灭菌30分钟。

1.3 配培养基 查阅复苏细胞培养基的相关信息，配置完全培养基。

1.4 实验方法

取细胞：从液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴锅中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
收集细胞：将细胞悬液移入加有3mL培养基的5mL离心管中，离心1000r/min，5分钟。
细胞培养：弃上清，根据沉淀量选择合适的培养皿或培养方瓶，用1mL培养基重悬沉淀，种到加有培养基的培养容器里，标记细胞种类、代次、日期、培养基种类、操作者姓名，放入二氧化碳培养箱中继续培养。

2. 细胞计数

2.1 血球计数板计数法

清洁：将血球计数板和盖玻片用酒精轻轻搽拭干净。
稀释细胞：用1mL培养基重悬、混匀消化好的细胞沉淀，再根据沉淀量选择倍数稀释细胞。
染色：稀释好的细胞与台盼蓝1:1混匀后，移液枪取10uL从计数板两侧沟槽内沿盖玻片下边缘滴入，使细胞悬液充满计数区，静置2分钟。
计数：血球计数板置于倒置显微镜下，计算四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方。若总数小于50个或大于100个，则应调整稀释倍数、重新计数，直至总数在50-100个之间。
公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104稀释倍数

2.2 细胞计数仪计数法

染色：将细胞悬液混匀后，用移液枪取10uL细胞悬液和10uL的台盼蓝在1.5mL EP管中混匀；
上样：取10uL混合液的加到Cell Counting Slide一侧的加样槽中，并在计数板同侧边缘标记好细胞种类；
设置参数：打开细胞计数仪，设置with Trypan Blue，确定后返回首页；点击protocol，根据细胞稀释倍数、细胞消化后圆度、细胞直径大小、噪音等数据设置参数；
读数：点击count，显示频上的活细胞浓度则为该细胞悬液的浓度。

3. 铺细胞（6孔板培养细胞）

3.1 标记培养板 使用6孔板时，先用镊子夹出支撑架，然后在每个孔内加入1.5mL培养基，再在板盖上标记细胞种类、实验类型。

3.2 种细胞 重悬消化好的细胞沉淀，估计实验所需细胞用量，将计数好的细胞悬液换算成要加的细胞体积，种到孔板中。

3.3 均匀分散细胞 将培养板放在桌面上十字交叉法或八字画法轻轻晃动培养板5-6次，使细胞均匀分散开来。

3.4 镜下观察细胞 分散细胞后将培养板在桌面上静置至细胞沉到底部，显微镜下观察细胞密度是否合适，少加多减。

3.5 培养细胞 调整细胞密度至合适后，将培养板放入二氧化碳培养箱继续培养至实验所需细胞密度。

4. 细胞固定

4.1 弃上清 用1mL的移液枪吸取上清丢弃至垃圾瓶。

4.2 清洗 将1mL PBS沿着孔板边缘轻轻加入孔板中将片子清洗一遍，弃掉。

4.3 固定 加1mL 通用型组织固定液室温下静置20分钟后弃掉。

4.4 清洗 将1mL PBS沿着孔板边缘轻轻加入孔板中，之后置于摇床上清洗3次，每次5分钟，清洗完成后就可以做染色或标记实验。

4.5 保存或运输 固定清洗后的细胞爬片，如果需要保存或运输，则需要用无菌PBS清洗2遍后，用干净的无菌PBS重新浸泡后4℃保存或运输，尽量一周内实验，期间可以用无菌PBS进行换液，防止长菌造成污染。