直接免疫荧光法是荧光抗体技术中最简单、最基本的方法。其通过荧光标记抗体直接与相应细胞（待检抗原标本）进行反应来鉴定相应表面分子。

其优点如下：

(1)  在反应中只有细胞和抗体两种成分参与，结果判断较简单；

(2) 特异性强，与其他抗原交叉染色较少；

(3) 操作步骤少，方法简便、省时。

1. 试剂及材料

(1) 荧光素标记的抗体及同型对照抗体。

(2) 细胞洗液：含2% BSA、0.1% NaN₃的 PBS。

(3) 固定液：1%多聚甲醛PBS液（pH=7.2）；pH值一定要调整准确，否则会影响检测结果。

(4) 流式细胞仪。

2. 操作方法

(1) 每个样品取2支流式检测管，分别标记同型对照、待测，分别加入10⁶个/100 μL待测细胞。若细胞浓度低，加入的细胞悬液较多，可1200 r/min离心10 min，弃上清液，留100 μL液体。

(2) 于同型对照管中加入荧光素标记的同型对照抗体作为阴性对照管，待测管中加入荧光素标记的抗体为实验管，各20 μL（按使用说明书）；混匀。

(3) 4℃孵育30 min，加入细胞洗液，1200 r/min离心10 min，洗涤2次。

(4) 去上清液，控干，加入固定液0.5 mL，混匀。

(5) 上机检测。先测阴性对照管，调节电压至阴性区，最后测实验管。

间接法也是目前比较常用的方法。首先用已知未标记的抗体（一抗）与待检抗原反应或用未知抗体与已知抗原反应，反应一定时间后，洗去未结合的抗体，再与荧光素标记的抗免疫球蛋白抗体（二抗）反应。在第一步反应中，若抗原与抗体发生了反应，则抗体被固定在标本上，那么第二步反应中荧光素标记的抗体（二抗）必然与第一步反应形成的抗原抗体复合物中的抗体发生反应，这样就可以通过二抗的示踪，对标本中未知抗原或抗体进行鉴定。

其优点如下：

(1) 灵敏度较高；

(2) 用一种荧光素标记的抗体，就能与一种以上相应的抗体或抗原配合鉴定多种未知的抗原或抗体。

其缺点如下：

(1)  在反应中有多种因子参与，容易产生非特异性染色，结果判断有时较困难；

(2) 操作步骤多，费时，细胞损失多。

间接法还有许多衍生的方法，如生物素标记染色法、三层染色法等。生物素标记染色法或三层染色法实际上是以生物素标记的二抗取代荧光素标记的二抗，再用荧光素标记的链霉亲和素或荧光素标记的抗生物素抗体来示踪，形成抗原-生物素标记的二抗-荧光素标记的链霉亲和素或荧光素标记的抗生物素抗体，前者为生物素标记法，后者为三层染色法。方法步骤与普通间接免疫荧光法一样，仅多一次标记与洗涤步骤。

1. 试剂及材料

(1) 一抗及其同型对照抗体（可不用）、荧光素标记的二抗。

(2) 细胞洗液：含2% BSA、0.1% NaN₃的PBS。

(3) 固定液：1%多聚甲醛PBS液（pH=7.2）；pH值一定要调整准确，否则会影响检测结果。

(4) 流式细胞仪。

2. 操作方法

(1) 每个样品取3支流式检测管，分别标记空白、同型对照、待测，依次加入10⁶个/100 μL待测细胞。若细胞浓度低，加入的细胞悬液较多，可1200 r/min离心10 min，弃上清液，留100 μL液体。

(2) 于空白管中加入细胞洗液，同型对照管中加入一抗同型对照（可不用，加入细胞洗液），待测管中加入一抗，各20 μL（按使用说明书），混匀。

(3) 4℃孵育30 min，加入细胞洗液，1200 r/min离心10 min，洗涤2次。

(4) 于空白管中加入细胞洗液，同型对照管中加入荧光素标记二抗作为阴性对照管（观察二抗本底），待测管中加入荧光素标记的抗体作为实验管，各20μL（按使用说明书），混匀。

(5) 4℃孵育30 min，加入细胞洗液，1200 r/min离心10 min，洗涤2次。

(6) 去上清液，控干，加入固定液0.5 mL，混匀。

(7) 上机检测。先测空白管，调节电压至阴性区，再测阴性对照管，最后检测实验管。

3. 注意事项

(1) 在使用前，一抗和二抗均应测试其合适的稀释度。

(2) 信号微弱的解决方法：

 ① 提高一抗和二抗的浓度。以此增强灵敏度，这必须测试各种抗体的滴度。

② 延长一抗和二抗的孵育时间。由于细胞染色时抗原吸附在固相载体上。抗原抗体结合时间较在溶液中长。孵育时间可因实验设计做适当调整，但少于20 min时抗体与抗原几乎不能有效结合。

在以上两点中，应摸索出一个最佳条件以产生有效信号且保持良好的背景。这就需要反复实验，因为每组抗体和抗原的情况会有所不同。

(3) 阴性对照背景不好的解决方法：

   ① 非特异性吸附：非特异性吸附背景问题的产生与抗原抗体的特异性结合无关。即一抗或二抗与样品相互作用而发生吸附，而不是与抗原发生特异性结合。

解决方法：将所有抗体溶液或含蛋白的检测试剂以100,000 g离心30 min去除蛋白聚合物；滴定一抗和所用的检测试剂，从而确定能够产生合适信号的最低浓度；用饱和量并不被检测试剂结合的非特异性抗体封闭样品，有效的封闭液包括5%的与标记二抗来源相同的同种血清，3% BSA和3%脱脂奶粉；缩短一抗或标记试剂的孵育时间；充分洗涤（增加洗涤次数）。

② 特异性背景：造成特异性背景问题的原因有三种，即污染抗体所致假阳性，交叉反应和样品中含有能与Ig结合的蛋白质。特异性背景难以通过封闭消除，只能通过更换抗体来消除或减低背景。

在临床实际检测工作中，最常用的是全血直接标记法。

1. 试剂及材料

(1) 一抗及其同型对照抗体。

(2) 细胞洗液：含2% BSA，0.1% NaN₃的PBS。

(3) 固定液：1%多聚甲醛PBS液（pH=7.2）；pH值一定要调整准确，否则会影响检测结果。

(4) 红细胞裂解液：NH₄Cl 4.16g、KHCO₃ 0.5g、EDTA·2Na 0.02g，溶于100 mL水中，调pH值至7.2，补充水至500 mL，4℃储存，使用时需恢复至室温。 

2. 操作方法

(1) 取出红细胞裂解液，恢复至室温待用。

(2) 每个样品取2支流式检测管，分别标记同型对照、待测，分别加入50~100 μL待测全血标本；于同型对照管中加入荧光素标记的同型对照抗体作为阴性对照管，待测管中加入荧光素标记的抗体为实验管，各20 μL（按使用说明书），混匀，4℃孵育30 min。

(3) 加入红细胞裂解液3~4 mL，室温避光裂解红细胞10 min，1200 r/min离心10 min，反复裂解红细胞直到无红细胞，一般2~3次。

(4) 去上清液，控干，加入细胞洗液或固定液0.5mL，混匀。

(5) 上机检测。先测阴性对照管，调节电压至阴性区，再测实验管。

3. 注意事项

(1) 另一种红细胞裂解液（Tris-NH₄Cl）：NH₄Cl 3.735g、Tris1.3g，溶于500 mL水中，0.22 μm滤膜过滤，4℃储存，使用时需恢复至室温。该裂解液裂解红细胞的时间一般为5 min。

(2) 裂解液裂解红细胞是一种利用细胞内、外存在盐离子浓度差导致细胞膜胀破的原理来裂解去除红细胞的最简便易行的方法，它既不损伤有核细胞，又能充分去除庞大数量的红细胞，以保证目的细胞的收集效率或结果分析的准确性。

(3) 直接标记法分为先标记抗体后裂解红细胞和先裂解红细胞后标记抗体两种方法，一般来说，两种裂解红细胞的标记方法大多适合常规的流式细胞术检测外周血或骨髓样品中的细胞及其亚群。但有研究报道某些红细胞裂解液对CD34等抗原阳性细胞的相对计数有不良影响，建议用流式细胞术检测或计数时慎重选择红细胞裂解液。

(4) 上述红细胞裂解法适合去除哺乳动物红细胞，但对禽鸟类红细胞效果不佳。

该法常用来检测两种或两种以上的抗原，其中一种抗原有荧光标记的抗体，而另一种抗原没有荧光标记的抗体。

1.  试剂及材料

(1) 荧光标记一抗、无荧光标记一抗及其同型对照抗体，荧光标记羊抗鼠二抗（一般情况下，一抗为单克隆，属小鼠源性；若为多抗，有时为兔源性，这时荧光标记二抗则应该为荧光标记羊抗兔二抗），羊IgG、鼠IgG（封闭用）。

(2) 细胞洗液：含2% BSA，0.1% NaN₃的PBS。

(3) 固定液：1%多聚甲醛PBS液（pH=7.2）；pH值一定要调整准确，否则会影响检测结果。

2. 操作方法

(1) 取1x10⁷个待测细胞，离心沉淀后，加入羊IgG（终浓度为0.2 mg/mL），封闭待测细胞表面的Fc受体或非特异性吸附位点，4℃孵育30 min，加入洗液6~8 mL，1200 r/min离心10 min，弃上清液；用洗液重悬，计数，调整细胞浓度至2x10⁷个/mL。

(2) 取3支流式检测管，分别标记空白、同型对照、待测，依次加入100 μL待测细胞（2x10⁶个/管），于同型对照管中加入20 μL同型对照抗体，待测管中加入20 μL无荧光标记一抗，空白管中不加入试剂，4℃孵育15 min。

(3) 加入洗液3~4 mL，1200 r/min离心10 min，弃上清液，重复洗涤2次，用100 μL洗液重悬细胞。

(4) 于各管加入荧光标记羊抗鼠二抗20 μL，4℃孵育30 min，加入洗液3~4 mL，1200 r/min离心10 min，弃上清液，重复洗涤2次，用100 μL洗液重悬细胞。

(5) 于各管加入鼠IgG（终浓度为0.2 mg/mL），封闭二抗多余结合位点或非特异性吸附位点，4℃孵育15 min。

(6) 于同型对照、待测管中加入荧光标记一抗20 μL，4℃孵育30 min，加入洗液3~4 mL，1200 r/min离心10min，弃上清液，重复洗涤2次，用300 μL固定液重悬细胞。

 （7）上机检测。空白管只加有荧光标记二抗，为双阴性；同型对照管中加有同型对照抗体、荧光标记二抗和荧光标记一抗，应该为荧光标记一抗单阳性；待测管中加有无荧光标记一抗、荧光标记二抗和荧光标记一抗，应该为双阳性（前提是该细胞同时表达两种抗原）。

3. 注意事项

在进行直接与间接免疫荧光混合染色时，原则上一般先进行间接标记，再进行直接标记。但在间接标记是细胞内染色时，应考虑固定或透膜剂对直接标记抗体与靶目标的亲和力或靶目标的抗原性的变化等影响，若影响大，则应该先标记直接抗体。