吸除培养上清液，用不含钙、镁离子的PBS漂洗1次。

以25mL培养瓶为例，加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或与0.02%EDTA的混合液），置室温（25℃）或37℃消化2~5min后，在倒置显微镜下观察，发现胞质回缩、间隙加大，立即吸除消化液，并加入等倍含血清的培养基终止消化。

用吸管吸取瓶内液体，反复吹打瓶壁细胞。吹打动作要轻柔并尽量避免产生泡沫。

转移至离心管中，1000r/min离心10min，离心洗涤1~2次，用洗液调整细胞浓度至1×10⁶个/mL备用。

1. 剪碎研磨法

将组织块用PBS或无血清的培养基漂洗后，置平皿中，用眼科剪剪成小块，再用研磨棒或玻璃注射器针芯研磨成匀浆，滴加适量的PBS或无血清的培养基，用移液管吹打混匀，经100目的滤网过滤，1000r/min离心10min，离心洗涤1~2次，用洗液调整细胞浓度至1×10⁶个/mL备用。

注意：该方法仅能处理部分软组织，对硬组织或纤维组织效果不好，且对组织细胞有一定的损伤。

2. 胰蛋白酶消化法

将组织块用无钙、镁离子的PBS漂洗后，置平皿中，用眼科剪剪成小块（1~2mm³），加入30倍组织量的蛋白酶溶液（0.25%胰蛋白酶，pH8.0），再转移至三角烧瓶中，置37℃水浴或恒温箱中20~60min，每隔5~10min振荡1次。若需长时间消化，可每隔15min取出2/3的消化上清液移入离心管中冰浴，或离心去除消化液后，加入含血清的培养基终止消化，另补充新消化液于三角烧瓶中继续消化。消化完毕后，将消化液或分次收集的细胞悬液经100目的滤网过滤，1000r/min离心10min，离心洗涤1~2次，用洗液调整细胞浓度至1×10⁶个/mL备用。

注意：胰蛋白酶消化法适用于消化间质较少的组织，如上皮、肝、肾等组织。钙、镁离子或血清会抑制其消化作用，消化过程中使用的液体应不含这些离子和血清。消化时间根据不同情况进行调整，温度低、组织块大，胰蛋白酶浓度低，消化时间长；反之，需缩短相应消化时间。新配的胰蛋白酶消化能力强，开始使用时应注意观察。另外，胰蛋白酶还常与EDTA（0.02%）按1:1的比例混合使用，以提高消化效率。

3. 胶原酶消化法

适用于分离纤维性组织、上皮及癌组织。钙、镁离子或血清不会抑制其消化作用，因而可用平衡盐溶液或含血清的培养基进行配制，这样可提高细胞存活率。其常用剂量为0.1~0.3μg/mL或200U/mL。消化方法基本同胰蛋白酶消化法，消化时间根据实际情况而定，1~2mm组织块，37℃水浴或恒温箱孵育，每隔5~10min振荡1次，消化时间一般为4~48h。消化充分的表现为组织块失去块的形状并分散，一经摇动即成细胞团或成单个细胞。

4. 多种酶联合消化法

将上述消化酶选择几种按不同比例组合，进行组织消化。

1. 宫颈脱落细胞悬液的制备

（1）用生理盐水冲洗宫颈表面的分泌物，用棉签轻拭宫颈表面，将棉签中吸附的脱落细胞洗脱到20mL生理盐水中。

（2）收集细胞悬液，1500r/min离心沉淀10min，用生理盐水洗涤2次，每次离心5min，弃上清液后重悬备用。

2. 食管脱落细胞悬液的制备

（1）将食管拉网器上的细胞洗脱到10mL生理盐水中，以1500r/min离心沉淀10min，再用生理盐水洗涤2次，每次以500~800r/min离心5min，弃上清液。

（2）调整细胞浓度为2×10⁶个/mL，备用。

（3）在标记染色前若发现细胞有团块聚集，可用0.5%胃蛋白酶（pH1.5~2.0）在37℃水浴箱中消化5~10min，振荡分散为单细胞悬液。

3. 胸腹腔积液脱落细胞悬液的制备

（1）抽取胸腹腔积液200~300mL，加入抗凝剂（肝素或枸橼酸钠）5mL，置4℃冰箱静置6~12h，弃上清液。

（2）留取沉淀液10~20mL，吸入试管内，用生理盐水洗3次，以1500r/min离心沉淀5min。

（3）离心沉淀后加入冷枸橼酸缓冲液5mL，在室温下放置20min。枸橼酸缓冲液制备：枸橼酸0.09mol/L，枸橼酸钠0.01mol/L。

（4）用300目筛网过滤后，用PBS洗去枸橼酸缓冲液，离心弃上清液，重悬备用。

4. 内镜刷检样品单细胞悬液制备

（1）将刷检的毛刷放入10mL生理盐水中洗脱，收集悬液进入试管，以1500r/min离心沉淀2min，弃上清液。

（2）用0.5%胃蛋白酶（pH1.5~2.0）在37℃水浴箱中消化10min，振荡分散为单细胞悬液。

（3）用300目筛网过滤，去除细胞团块。以1500r/min离心沉淀2min，弃上清液，重悬备用。

1. 小鼠心脏淋巴细胞

（1）分离心脏并剪碎：剥离出心脏，剪开并去除其他非心肌组织，用冷的Hank's平衡盐溶液冲洗干净，放入平皿中用眼科剪将其剪碎成1mm³小组织块。

（2）消化：用3mL含10%胎牛血清的1640培养基重悬并移至离心管内，加入终浓度为250U/mL的I型胶原酶。将离心管置于振荡器上，250r/min，37℃恒温振荡30~40min。

（3）终止消化：将振荡分散的细胞悬液通过100目尼龙网过滤，加入1640培养基洗涤2次，每次250r/min离心10min，去除上清液。用3mL含10%胎牛血清的1640培养基重悬细胞。

（4）Ficoll分离：在另一离心管中加入3mL的Ficoll-Plus梯度离心分离液，小心将上述细胞悬液叠加在分离液之上，800r/min离心20min。

（5）收获细胞：仔细吸出1640培养基与分离液之间的细胞层，用1640培养基离心洗涤2次（250r/min，10min），重悬于含10%胎牛血清的1640培养基中，细胞计数，备用。

2. 小鼠肝脏淋巴细胞

（1）常规取小鼠肝脏并剪碎：常规取小鼠肝脏，充分剪碎肝脏组织，置100目尼龙网上轻轻研磨，同时用20~30mL含2%胎牛血清的HBSS液冲洗，滤液转入50mL试管中冰上静置5min。将上清液置另一试管中，4℃、800r/min离心10min。

（2）Percoll淋巴细胞分离液分离：细胞沉淀用40%Percoll淋巴细胞分离液悬起并混匀，室温、2000r/min离心20min，小心吸弃上层肝脏实质碎片及上清液。

（3）洗涤细胞：细胞沉淀用HBSS液洗涤2次后，加入红细胞裂解液置冰浴5min，加入9倍体积的HBSS液终止反应，离心后再用HBSS液洗涤2次，台盼蓝染色后观察细胞活力。备用。

注意：①也可用酶消化法制备肝脏单细胞悬液。消化液为含0.05%胶原酶和0.001%DNA酶的1640培养基，肝脏剪碎成1mm³小块，37℃水浴振荡消化30min，后续步骤相同。②机械法和酶消化法是制备肝脏单细胞悬液常用方法。有报道酶消化可降低人肝脏NK细胞的CD56⁺细胞比例，提示酶消化法制备单细胞悬液不适合用于肝脏NK细胞表型研究。③上述酶消化法也可降低DX5细胞和NK1.1⁺细胞的比例。

3. 小鼠小肠黏膜淋巴细胞

小肠黏膜免疫系统包括三种基本淋巴细胞成分。第一种是分布在各种黏膜上皮细胞内的淋巴细胞，为上皮内淋巴细胞（IEL），其中以CD8⁺T淋巴细胞为主。第二种是散在于黏膜系统中各固有层的淋巴细胞（LPL），含有各种表型的T及B淋巴细胞。第三种是集合淋巴结（PP结）中的淋巴细胞。它们的组成及功效都不同。

（1）取出小肠并冲洗：脱颈处死小鼠、开股，立即取出从幽门至回盲部的全部小肠，仔细剥离肠系膜和脂肪。侧开口（保护肠壁），用20mL注射器吸取含5%新生牛血清的D-Hank's液冲洗肠腔，尽量将肠内容物冲洗干净，冲洗过的小肠置于盛有少量D-Hank's液的平皿中以保持湿润。

（2）分离PP结：肉眼观察PP结，测量其直径，记录个数。用眼科弯剪剪下PP结，置于盛有D-Hank's液的平皿中，用机械挤压的方式研磨PP结，用300目的尼龙网过滤，4℃备用。

（3）翻转小肠：将冲洗过的小肠置于盛有少量含5%新生牛血清Hank's液的平皿中，以保持湿润，用细绳穿过肠腔，用缝合线将小肠回盲部结扎紧，翻转小肠使黏膜面向外。

（4）分离IEL：翻转后的小肠用含抗生素的D-Hank's液洗2次，置于37℃预热的盛有15mL消化液（含0.1%Il型胶原酶的1640培养液）的50mL离心管中，将离心管放入恒温箱中孵育消化40min，充分振荡后，取出小肠，用D-Hank's液冲洗2次，放入另一预热的盛有10mL消化液的50mL离心管中继续消化40min，以制备LPL。消化液用300目的尼龙网过滤，1000r/min离心沉淀5min，去除上清液，加入含5%新生牛血清的1640培养液调整体积至4mL，再加入100%Percoll分离液至10mL，充分混匀后成为40%细胞-Percoll混悬液，用毛细吸管在试管底部轻轻加入2mL 70%Percoll分离液，使两层液体间形成清晰的界面，制成Percoll梯度分离液。25℃600g离心20min。收集40%与70%界面间的细胞，用含5%新生牛血清的1640培养液洗3次，即为IEL。4℃备用。

（5）分离LPL：将经过上述消化液振荡消化40min后的离心管充分振荡，取出小肠，消化液用300目的尼龙网过滤，滤液经Percoll梯度分离、洗涤后，沉淀重悬即为LPL（步骤同上）。

注意：先后用含0.1%II型胶原酶的1640培养液消化40min，是分离较高纯度IEL与LPL的关键。上述操作既避免了上皮层过度解离，使获取的IEL中混入少量LPL，又可避免上皮层解离不足，使LPL中混入少量IEL。

4. 小鼠子宫淋巴细胞

（1）小鼠子宫分离：摘眼球放血后断颈处死，迅速打开腹腔，分离小肠以及覆盖在子宫上的脂肪，取出子宫用1XPBS冲洗，然后置入事先准备好的滤纸上，粘去残留脂肪，并剔除与子宫相连的血管。对于处女鼠和怀孕早期（≤6天）的小鼠，用剪刀沿子宫光滑面剪开，以充分暴露子宫内膜，对于怀孕中期（10～12天）、怀孕晚期（≥14天）的小鼠，剪开子宫后，将胎儿及胎盘去除干净，再用1XPBS冲洗。

（2）机械法分离小鼠子宫内膜淋巴细胞：将子宫组织置于200目不锈钢网上，用组织剪充分剪碎，至小块体积小于1mm³，用研磨棒轻轻研磨，同时用10mL含2%小牛血清的1640培养液冲洗，滤液转入15mL离心管，冰上静置30min，将上清液转入另一试管中，4℃、2500r/min离心10min。细胞沉淀用2mL40%Percoll液悬起并振荡混匀充分，室温、2000r/min离心20min，小心吸弃上层子宫实质碎片及上清液。沉淀加入红细胞裂解液1mL，置冰浴2min。加入五倍体积的1XPBS，终止反应，离心洗涤后，重悬备用。

（3）酶消化法分离小鼠子宫内膜淋巴细胞：将子宫剪碎成体积小于1mm³的小块，加入5mL消化液（含0.25%胰蛋白酶和0.001%DNA酶的1640培养液），用胶头滴管吹散组织，置37℃CO₂培养箱中消化1h，每过10min吹打1次，然后加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液终止反应。再用200目网过滤，沉淀、悬浮备用。

注意：前面提过胶原酶法制备单细胞悬液不适合用于肝脏NK细胞表型研究，可降低DX5+和NK1.1+细胞比例，此胰蛋白酶法虽然不影响DX5表达，但能降低某些CD分子的表达，如CD69等，故在选择酶消化法时，需要视检测目的比较机械法与酶消化法后决定。

5. 小鼠脾脏、淋巴结以及胸腺淋巴细胞

脾脏和淋巴结均属外周免疫器官，分别起着滤过血液的作用。外周血淋巴细胞可凭借淋巴细胞再循环途径进入脾脏和淋巴结，来自骨髓和胸腺成熟的各类淋巴细胞则经血液驻入这些外周免疫器官的特定区域。脾脏位于左侧上腹部，与主动脉环直接相连，体积较大；淋巴结则广泛分布于机体各处，在某一特定的解剖部位成群存在，如腹股沟、颈部、腋窝等处。脾脏淋巴细胞以成熟B淋巴细胞为主，占60%左右，成熟T淋巴细胞则占30%左右。淋巴结细胞以成熟T淋巴细胞为主。胸腺为T淋巴细胞发育的中枢免疫器官，大多数哺乳类动物的胸腺位于纵隔前上方（胸腔内）。胸腺细胞是各个分化阶段的T淋巴细胞，紧密堆积于上皮细胞之间，髓质含成熟的T淋巴细胞和巨噬细胞。

（1）制备脾细胞或淋巴结细胞悬液：将大鼠或小鼠颈椎脱位处死后，置70%乙醇中浸泡3~5min，取出后取右侧卧位，剪开左侧背腹交界处皮肤，无菌取脾脏置于盛有不含小牛血清的RPMI1640不完全培养液的平皿中，洗去血迹，剪去脂肪及筋膜组织，于金属网上研压，收集网下的细胞悬液注入无菌离心管中，用不完全培养液洗两次并重新悬浮；可采用裂解红细胞的方法裂解红细胞，用于免疫细胞的检测。

（2）脾细胞或胸腺单个核细胞的分离：将上述制备的脾脏或淋巴结细胞悬液缓慢置于聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-hypaque，F-H）分层液上（大鼠的脾脏或淋巴结细胞悬液选用比重为1,084的分层液，小鼠则选用比重为1.080的分层液），2000~3000r/min离心20 min，吸取第二层云雾状的低密度细胞，经1000r/min离心洗涤两次后，配成所需浓度细胞悬液，既可用于免疫功能的测定，又可用于进一步纯化各类免疫细胞。

6. 人肿瘤浸润淋巴细胞

一般来说，肿瘤浸润淋巴细胞的分离均采用酶消化法与不连续密度梯度分离相结合的方法。酶消化也需视肿瘤组织的来源选择不同的消化液，包括消化液中蛋白酶的种类、组分与浓度、消化温度与时间。其基本步骤：①去除坏死的肿瘤组织与脂肪组织，剪成1mm³小块；②酶消化；③终止酶消化，过滤，不连续密度梯度分离；④洗涤备用。在此仅以人消化道肿瘤浸润淋巴细胞的制备为例，其他肿瘤组织淋巴细胞则仅介绍消化条件和不连续密度梯度分离液组分。

注意事项：①在使用酶消化法时，要重视酶种类的选择，如：含有大量结缔组织的肿瘤（食管癌、乳腺癌或皮肤癌等）宜选用胶原酶；胰蛋白酶更适用于消化细胞间质较少的软组织（如胚胎、上皮与肾组织等）；②要注意条件的选择和影响因素，如溶液的pH值以及酶消化的时间、温度与浓度等；③组织标本应及时处理保存，以避免在室温下放置时间过长，导致中心组织坏死或细胞自溶，影响流式细胞术检测结果；④以下方法均来自相关文献，未亲自实验过，可参考、适当调节使用。

（1）人消化道肿瘤浸润淋巴细胞（胃、结肠与直肠等肿瘤组织）。

①单细胞悬液制备：取手术切除的肿瘤组织，去除表面出血、坏死及脂肪组织，剥除消化道黏膜层，称重，浸于含1000μg/mL青霉素、1000pg/mL链霉素、5μg/mL两性霉素B的D-Hank's液中30min，加入终浓度为0.25%的胰蛋白酶预消化30min，取出肿瘤组织，剪成1mm³小组织块。

②酶消化：加入适量的蛋白酶混合液（含0.05%II型胶原酶、0.002%DNA酶与0.05%透明质酸酶的RPMI1640培养液），室温磁力搅拌消化6~8h。

③不连续密度梯度分离：经200目滤网过滤，洗涤。将100%、75%和10%的Percoll分离液依次加入试管，单细胞悬液铺于最上层，室温400g离心20min，收集100%和75%Percoll分离液两层之间的细胞，即为淋巴细胞，洗涤备用。

（2）人肺癌组织淋巴细胞。

①消化条件：消化液为含0.05%II型胶原酶、0.002%DNA酶的1640培养液或含0.05%II型胶原酶、0.001%DNA酶与0.06%透明质酸酶的RPMI1640培养液。消化温度与消化时间：4℃磁力搅拌消化20h或37℃磁力搅拌消化4h。

②Percoll分离液：100%和75%Percoll分离液，室温400g离心20min。

（3）人喉癌组织淋巴细胞。

①消化条件：消化液为含0.25%胰蛋白酶的RPMI1640培养液，37℃磁力搅拌消化45~60 min。

②Percoll分离液：密度为1.088与1.075的Percoll分离液，室温1500r/min离心20 min。

（4）人脑胶质瘤组织淋巴细胞。

①消化条件：消化液为含0.25%胰蛋白酶的RPMI1640培养液，37℃磁力搅拌消化。

②Percoll分离液：100%与75%Percoll分离液，室温400g离心20min。

（5）人卵巢癌组织淋巴细胞。

①消化条件：消化液为含0.1%II型胶原酶、0.002%DNA酶与0.01%透明质酸酶的RPMI1640培养液。消化温度与消化时间：37℃磁力搅拌消化4h。

②Percoll分离液：100%与75%Percoll分离液，室温400g离心20min。

（6）肝癌组织淋巴细胞。

①消化条件：消化液为含0.05%II型胶原酶、0.003%DNA酶的1640培养液，室温磁力搅拌消化6h，4℃磁力搅拌继续消化18h；或用含0.05%II型胶原酶、0.003%DNA酶与0.08%透明质酸酶的RPMI1640培养液，室温磁力搅拌消化10h。这两种酶消化法还可应用于正常组织与其他肿瘤组织，如软组织、舌癌、牙龈癌、结肠癌与肺癌等。

②Percoll分离液：100%与75%Percoll分离液，室温400g离心20min。

7. 石蜡包埋组织

在染色和组织病理分析前，常把手术或尸体解剖时获得的组织块固定后，用石蜡包埋来保存，这样可保存许多年。石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围。

（1）取材：从包埋块中切取两三块50μm厚的组织块切片，取3~5片于10mL试管中，加入5~8mL二甲苯，室温脱蜡2次，每次10min。

（2）水化：依次加入100%、95%、70%、50%的乙醇5mL，每步10min，最后弃乙醇，加入蒸馏水3~5mL。

（3）消化：加入2mL0.5%胰蛋白酶溶液、1mL1%胃蛋白酶溶液（pH1.5），置37℃恒温水浴中消化30min，每隔10min振荡器振荡一次。

（4）终止消化：加入生理盐水终止消化。

（5）收集细胞：300目尼龙网过滤，收集细胞悬液，1000r/min离心10min，用生理盐水洗涤2次，最后以500~800r/min离心沉淀10min；备用。