01 常规的细胞冻存步骤

一、实验前准备

（1）实验前准备：将程序降温盒恢复至室温。

（2）冻存液配制：

① 70% DMEM，20% 血清，10% DMSO。

② 90% 血清，10% DMSO

配好后置于4℃备用（可保存1周）。

二、细胞冻存

（1）润洗、消化、终止消化、离心等步骤均同细胞传代。

（2）离心后弃去上清液，用冻存液重悬细胞。

（3）取出灭过菌的冻存管，将细胞悬液分装入冻存管，每管1 mL。用封口膜将管盖封好，在管口贴上一层白色胶布，在胶布上再次标明细胞相关信息-细胞名称，代数和冻存时间（年-月）。

（4）将冻存管放入程序降温盒中，将程序降温盒置于-80℃冰箱过夜。

（5）取出程序降温盒，将细胞转移至液氮罐中。

（6）做好冻存登记，详细记录细胞置于液氮罐中细胞盒的具体位置。

 三、注意事项

（1）用记号笔在冻存管管壁上做好标记，标明细胞名称、代数、冻存者、冻存日期，以防白色胶布脱落后无法识别细胞种类。

（2）将冻存管管盖拧紧，以免液氮进入冻存管，复苏时爆炸，防止复苏细胞时水进入冻存管内。

（3）注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。

（4）及时添加程序降温盒中的异丙醇。

根据细胞的类型、冻存条件和冻存液的配方等因素，细胞在-80℃冰箱中的保存时间有所不同。通常情况下，细胞可以在此温度下保存几个月至一年不等。然而，对于某些特定细胞类型和使用优化冻存液的情况下，其保存时间可能会更长。总体而言，-80℃冰箱适合短期保存细胞，若需要长期保存，则建议将其转移到液氮中以实现更稳定的保存状态。如果因为周末、设备安排等原因多放了1～2天，细胞不一定马上失活。但放得越久，复苏后的细胞活率和状态越难保证。如果拖延的时间更长，就不建议再把该细胞样本当作标准冻存细胞使用。

02 不同类型的细胞的低温冻存耐受能力差异

一般而言，部分连续传代的肿瘤细胞系或永生化细胞系耐冻性相对较好。这类细胞增殖能力较强，对冻存和复苏过程中的损伤耐受度也相对较高。在冻存液配方、细胞状态和降温速度合适的情况下，即使在-80℃保存时间稍长，复苏后仍可能保持较高的存活率，部分情况下可达到80%左右甚至更高。

相比之下，原代细胞、干细胞以及部分对培养条件要求较高的细胞通常更加敏感。长时间处于-80℃环境中，更容易受到冰晶形成、细胞膜损伤和温度波动等因素影响。随着保存时间延长，复苏后的活细胞数量可能明显减少，同时还可能出现贴壁能力下降、增殖速度变慢、细胞形态异常等情况。

03 细胞在冻存前的状态和处理方式

首先是冷冻保护剂。常见的细胞冻存液中会加入DMSO，部分细胞也可使用甘油等保护剂。DMSO能够进入细胞，降低冷冻过程中冰晶形成对细胞膜和细胞器造成的损伤，从而提高复苏后的细胞存活率。不过，DMSO本身对细胞也有一定毒性，因此浓度和接触时间都需要控制。哺乳动物细胞冻存液中常见的DMSO浓度为5%～10%，具体比例应根据细胞类型和冻存方案确定。

其次是冻存前的细胞状态。一般建议选择生长状态良好、处于对数生长期的细胞进行冻存。如果细胞已经出现大量死亡、过度融合、营养不足或污染，即使冻存步骤完全正确，复苏后的状态通常也不会理想。

冻存密度同样需要控制。细胞浓度过低，复苏后活细胞数量不足，恢复速度较慢；细胞浓度过高，则可能影响冻存液与细胞的充分接触。建议应按照细胞库、试剂说明书或已有培养经验确定。

另外，降温速度是细胞冻存过程中非常关键的一步。多数哺乳动物细胞通常采用约1℃/min的速度缓慢降温。降温过快容易形成较多细胞内冰晶，损伤细胞膜和细胞器；降温过慢则可能导致细胞过度脱水，同样会影响存活率。实验室通常使用程序降温盒或程序降温仪，使细胞逐步降至-80℃。

04 冷冻保护剂的种类和浓度

目前细胞冻存中最常用的是DMSO（二甲基亚砜）。DMSO能够进入细胞内部，减少冷冻过程中细胞内冰晶的形成，从而降低细胞膜和细胞器受到的损伤。对于多数哺乳动物细胞，冻存液中的DMSO浓度通常在5%～10%左右。

DMSO本身具有一定的细胞毒性，浓度过高或细胞在室温下接触DMSO时间过长，都可能降低细胞活率。加入冻存液后通常需要尽快完成分装和降温，细胞复苏后也应及时稀释或去除DMSO。

甘油也是常见的冷冻保护剂，更多用于某些特定细胞、微生物或其他生物样本的冻存。部分冻存剂还会加入海藻糖、蛋白质或其他保护成分，用于降低细胞膜损伤和渗透压变化带来的影响。

常规肿瘤细胞系和永生化细胞系通常对DMSO耐受性较好，常规冻存液即可获得较好的复苏效果；而原代细胞、干细胞、免疫细胞等较敏感细胞，对DMSO浓度、冻存液组成和降温条件的要求往往更高。

某些敏感细胞还需要使用专门配制的无血清冻存液或商业化冻存液，以提高复苏后的活率和功能稳定性。冻存细胞时优先参考细胞供应商、细胞库或试剂厂家的推荐方案，根据细胞类型确定冷冻保护剂及其浓度。

05 -80℃冰箱在实际使用过程中温度波动

频繁开关冰箱门、一次取放大量样品、冰箱装载量变化、样品距离门体过近以及设备运行状态异常，都可能导致局部温度出现波动。

对于冻存细胞来说，反复的温度升高和降低比单纯保持在低温状态更不利。温度波动可能增加冰晶重新形成或生长的风险。随着保存时间延长，损伤逐渐累积。-80℃只能作为细胞冻存过程中的短期过渡环境，而不是常规长期储存条件。多数哺乳动物细胞通常在-80℃完成降温后，于数小时至24小时左右转入液氮或更低温度环境。

如果需要长期保存细胞，更推荐使用液氮储存。液氮温度约为-196℃，实际细胞库也常采用液氮气相进行保存。在这样的深低温条件下，细胞内的生化反应和分子运动被大幅抑制，更有利于长期保持细胞的活性和生物学特性。

在冻存流程规范、温度稳定的情况下，细胞可以在液氮中保存多年。因此，如果是珍贵细胞、原代细胞、干细胞或需要建立长期细胞库，完成-80℃降温后应尽快转入液氮保存。

06 没有及时转入液氮怎么补救

只要冻存管一直保持在-80℃、没有反复拿出、没有出现部分融化，一般不建议直接报废。应尽快转入液氮保存，同时取一管做复苏验证。复苏后重点观察细胞活率、贴壁情况、形态和增殖速度。如果是干细胞、原代细胞或后续要做功能实验，还要进一步确认关键表型和功能是否正常。

如果只是在-80℃多放了1～2天，很多常规细胞系通常仍有较大概率正常复苏；如果已经放了数周甚至更久，只凭时间判断就不管用了，最好实际复苏一管验证。

如果冻存管曾经出现部分融化、反复冻融、温度明显升高，则不建议直接把它当作正常细胞库继续长期保存，最好先复苏评估；状态正常后，再重新培养、扩增并规范冻存一批新的细胞。

⚠️ 如果冻存管出现破裂、漏液、管盖松动或密封异常，不要直接放入液氮，以免带来污染或安全风险，应按实验室SOP处理。