做 Western Blot（WB）实验时，蛋白提取并定量后，加入Loading Buffer，通常会把样放进金属浴或者 PCR 仪里加热3-5分钟。实验室里习惯把这个过程叫作“煮蛋白”。

对于经常做 WB 的人来说，这几乎已经成了固定操作。那为什么上样之前一定要把蛋白“煮”一下？如果不煮会怎么样？是不是所有蛋白都可以直接95℃加热？

其实，“煮蛋白”是 WB 样品制备过程中非常关键的蛋白变性处理。这个步骤的目的是尽可能消除不同蛋白天然结构和自身电荷的影响，让蛋白在 SDS-PAGE 中主要按照分子量大小进行分离。

天然状态下的蛋白质并不是一条笔直的多肽链。蛋白合成以后，会通过氢键、疏水作用、离子相互作用、范德华力以及二硫键等作用，折叠形成特定的二级、三级甚至四级结构。有些蛋白还会形成二聚体、多聚体，或者与其他蛋白组成更复杂的复合物。

（蛋白质结构，图源：网络）

SDS-PAGE的原理是不同的蛋白能够根据分子量大小进行分离。如果蛋白仍然保持天然构象，那么它在凝胶中的迁移速度就不仅仅受到分子量影响，还会受到蛋白空间形状、表面电荷以及聚合状态等因素影响。同样是50 kDa左右的蛋白，如果一个高度折叠、另一个处于多聚体状态，它们在胶里的迁移行为就可能完全不同。

因此加热在这里发挥了重要作用，破坏了维持蛋白高级结构的多种非共价相互作用，使蛋白逐渐失去原本的空间构象，变成更加伸展的多肽链。

常规 WB 使用的是SDS-PAGE，因此样品处理并不是单纯依靠高温完成的，而是需要高温、SDS 和还原剂共同发挥作用。

Loading Buffer 中最重要的成分之一就是SDS，也就是十二烷基硫酸钠。SDS 是一种阴离子表面活性剂，它能够与蛋白质结合，一方面进一步破坏蛋白的天然结构，另一方面会给蛋白附加大量负电荷。

蛋白本身的氨基酸组成不同，所以天然状态下不同蛋白携带的电荷差异也很大。如果直接电泳，电荷差异会明显影响迁移速度。而经过 SDS 处理后，蛋白自身原有的电荷差异会被大幅削弱，不同蛋白的荷质比趋于接近。

经过“煮蛋白”处理后，在电场作用下，蛋白跑得快还是慢，主要就取决于它的分子量：分子量越小的蛋白越容易穿过凝胶孔隙，迁移得更快；分子量越大的蛋白迁移得更慢。

很多 Loading Buffer 中还会加入DTT或β-巯基乙醇，这两种物质属于还原剂，它们主要负责处理另一种比较“顽固”的结构——二硫键。

二硫键属于共价键，相比普通的氢键和疏水作用更加稳定。有些蛋白内部靠二硫键维持结构，也有些蛋白的不同亚基之间通过二硫键连接。仅靠 SDS 和加热，并不一定能够彻底破坏这些连接，因此通常还需要加入还原剂。

如果蛋白变性不充分，一个理论分子量为50kDa的蛋白，却仍以二聚体形式存在，可能会在更高的分子量区域出现条带。不同状态的蛋白同时存在时，还可能出现条带弥散、拖尾或者多条异常条带。更加严重的情况下，蛋白在加样前已经形成较大的聚集体，这些聚集体很难正常进入分离胶，最终可能堆积在加样孔附近或者浓缩胶顶部。

（蛋白堆积在顶部，图源：小红书 @爱吃榴莲）

因此，当 WB 出现高分子区域聚集、目的条带异常偏移或者泳道顶部信号很强时，除了考虑抗体、电泳和转膜问题，也应该检查一下样品是否充分变性。

WB蛋白到底应该怎么“煮”？

对于大多数常规可溶性蛋白：

蛋白提取完成后，先通过BCA 等方法进行定量，再调整各组蛋白浓度和上样量，然后加入SDS-PAGE Loading Buffer。如果使用的是5×Loading Buffer，通常按照蛋白样品与5× Loading Buffer为4∶1的比例混合；如果是4×Loading Buffer，则一般按照3∶1混合。

混合后可以轻轻吹打或涡旋，使样品充分混匀，再短暂离心，将管壁和管盖上的液体收集到底部。95℃加热5～10分钟。加热结束后稍微冷却，再短暂离心一次，就可以直接进行SDS-PAGE上样。

对于部分膜蛋白、多跨膜蛋白以及本身容易聚集的蛋白

可以尝试降低加热温度，比如使用70℃加热约10分钟，或者根据目标蛋白性质和抗体说明书选择更加温和的变性条件。

如果某个蛋白一直存在条带偏弱、高分子区域聚集或者目的条带莫名消失的问题，而其他实验条件都没有明显异常的情况下，可以考虑变性条件的排查。

加热的目的是让蛋白充分变性，并不是时间越长越保险。长时间处于高温条件下，部分蛋白可能出现聚集、沉淀甚至降解，最终反而影响 WB 结果。

对于普通样品来说，没有特殊需求的情况下，95℃加热5～10分钟通常已经足够，没有必要为了“变性更彻底”无限延长时间。

另外，如果使用的Loading Buffer 本身不含DTT 或 β-巯基乙醇，也需要确认实验是否要求额外加入还原剂。如果还原剂缺失，即使经过高温处理，某些依赖二硫键连接的蛋白也可能无法充分解离。