做Western Blot 时，我们需要考虑到抗体能不能识别目标蛋白、是否适用于样本物种，以及能否在WB 的变性条件下稳定识别目标条带。

✅️所以，选择一抗时，要按照实验需求逐项判断。

选择一抗的实用顺序：

确认目标蛋白名称👉亚型和修饰位点👉样本物种👉查看是否明确适用于WB，👉根据蛋白丰度选择单克隆或多克隆抗体👉结合内参、一抗宿主和二抗体系完成搭配。

总结起来，WB一抗选择主要看六点：

靶点是否准确、样本物种是否匹配、是否经过WB验证、单抗或多抗是否适合、宿主能否与检测体系配套、灵敏度是否符合蛋白丰度。

一、先明确目标蛋白信息

同一个蛋白可能存在多个名称或亚型，例如p53 也可写作 TP53；AKT 又可分为 AKT1、AKT2、AKT3。如果研究对象是某个特定亚型，就要确认抗体识别的是总 AKT，还是只识别其中一种亚型。

如果检测的是磷酸化蛋白，还要进一步明确修饰位点。例如：

总AKT 与 p-AKT 不是同一种检测目标； 

p-AKT Ser473 与 p-AKT Thr308 也不能混用； 

检测磷酸化蛋白时，通常还要同时检测对应的总蛋白。

此外，建议提前查询目标蛋白的理论分子量，用于判断条带是否出现在合理位置。但实际条带可能受到剪切、糖基化、磷酸化或聚合状态影响，不能只根据理论分子量下结论。

二、确认抗原样本物种

一抗宿主选取与样本不同种属（小鼠样本-兔源一抗），减少交叉反应。

抗体说明中的Reactivity，表示这支抗体能够识别哪些物种来源的目标蛋白，例如Human、Mouse、Rat、Rabbit。

假设实验样本来自大鼠，就要确认抗体对Rat 具有反应性；样本来自人源细胞，就要确认其覆盖 Human。

样本物种不等于抗体宿主（Host Species）。“兔抗人蛋白”表示抗体由兔产生，但检测的是人源目标蛋白。兔源抗体并不是只能检测兔样本，鼠源抗体也不是只能检测小鼠样本。

跨物种使用时，还要考虑目标蛋白在不同物种间的序列同源性。如果抗体没有明确验证目标物种，即使理论上可能识别，还是要先做预实验确认。

三、确认抗体适用于WB

一支抗体适合免疫组化或免疫荧光，不代表它一定适合Western Blot。

WB 中的蛋白通常经过 SDS、还原剂和高温处理，蛋白结构已经发生变性。有些抗体识别的是天然构象表位，在 IF 或 IHC 中效果很好，但到了 WB 中可能完全没有条带。

因此，选择时要重点确认应用范围中明确包含：WB 或 Western Blot。

❌ 如果只标注了IHC、IF、IP，而没有 WB，不建议直接用于正式实验。

四、单克隆还是多克隆

单克隆抗体只识别一个抗原表位，通常特异性较好、背景较干净，批次稳定性也相对更高，适合：

定量WB； 

磷酸化位点检测；

同源蛋白较多的靶点；

对特异性要求较高的实验。

但单抗只识别一个表位，如果该表位被修饰、遮挡或破坏，可能出现识别不到的情况。

多克隆抗体可以识别目标蛋白上的多个表位，通常灵敏度较高，对蛋白结构变化的容忍度更好，适合：

低丰度蛋白；

初步筛查；

目标蛋白表位容易发生变化的情况。

它的不足是更容易出现杂带，批次之间也可能存在一定差异。

所以，单抗和多抗没有绝对的好坏。常规定量实验可优先考虑特异性稳定的单克隆抗体；目标蛋白丰度较低时，可考虑高质量多克隆抗体。

五、兔抗还是鼠抗

兔源抗体通常亲和力和灵敏度较高，比较适合低丰度蛋白检测；鼠源抗体种类多、应用成熟，很多常见蛋白都有稳定的鼠单抗。

但宿主选择不能只看“谁的信号更强”，还要考虑整套检测方案。

例如，目标蛋白一抗是兔源，内参一抗是鼠源，就可以分别使用抗兔二抗和抗鼠二抗，更方便区分。如果目标蛋白和内参都使用兔源一抗，同时孵育时就容易被同一种二抗识别。

因此，选择一抗宿主时，要提前考虑：

是否要同时检测目标蛋白和内参；

是否进行双色荧光检测；

是否需要多重WB； 

实验室现有二抗能否匹配。

六、结合目标蛋白丰度选择

不同蛋白的表达丰度差异很大。

GAPDH、β-actin 等高丰度蛋白，高灵敏度反而容易出现信号过强、条带饱和。

对于转录因子、膜蛋白、磷酸化蛋白等中低丰度目标，应优先考虑亲和力较高、验证较充分的一抗，并结合样本类型适当优化上样量和孵育条件。

如果目标蛋白极低丰度，仅靠增加一抗浓度不一定有效，还要考虑蛋白提取效率、上样量、转膜条件和显色系统。