1、细胞总蛋白提取

1）悬浮细胞

1000rpm，4℃，5 min，离心收集细胞沉淀，每5*10^6的细胞量加入200 ul RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂，配比为RIPA：cocktail：PMSF：磷酸化蛋白酶抑制剂=100：2：1：1），涡旋振荡15秒；

2）贴壁细胞

用PBS冲洗细胞2-3次，最后一次清洗完后倒掉pbs，用移液器尽量吸干残留液体；加入适当体积的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂，配比为RIPA：cocktail：PMSF：磷酸化蛋白酶抑制剂=100：2：1：1）于培养板/培养瓶内3-5min。期间反复晃动培养板/瓶，使裂解液与细胞充分接触；用细胞刮刀收集细胞并转移到1.5ml离心管中；冰上裂解30min，期间可用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解；12000rpm, 4℃，离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。

2、组织总蛋白提取

1）组织取材前准备好组织蛋白稳定保存液（WB专用）；组织块用预冷的PBS洗涤1-2次后直接放入组织蛋白稳定保存液（WB专用），有利于防止取材过程中蛋白降解；

2）完全裂解液的配制：配制4.5mL完全裂解液，配比为：RIPA裂解液(强）：50×cocktail：PMSF ：磷酸化蛋白酶抑制剂=100：2：1：1

3）组织研磨：取4个研磨管，做好标记（心、肝、肾、脑），分别加入3颗3mm的研磨珠、1mL上述配制的完全裂解液，再加入分割成绿豆大小（约50mg）的组织样本，设置研磨程序（肝脾）进行组织研磨；

4）将研磨完成的研磨管取出，放置冰上或四度裂解液30min；

5）12000rpm，4℃，离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。蛋白浓度测定：根据需要进行蛋白浓度测定, 取未变性的蛋白溶液，用即用型BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度，具体方法参照试剂盒说明书;

3、蛋白变性

将蛋白溶液按照4：1的比例加入5*还原型蛋白上样缓冲液（如向100μL蛋白溶液加入25μL上样缓冲液），漩涡混匀仪混匀，掌上离心机瞬时离心，置金属浴95℃变性5min，收入-20℃或-80冰箱保存备用。实操无需放入冰箱，直接使用；

4 、改善拖尾现象

将上述变性好的蛋白溶液，分别取50μL至新1.5mL EP管中，加入50μLWB蛋白拖尾优化试剂，混合均匀并室温静置10 min，最后补加5× loading buffer 12.5μL，混匀，待上样。

5、SDS-PAGE 电泳 【制胶仪制胶 2 块 + 制胶试剂盒制胶 2 块】

1）清洗玻璃板：将玻璃板先用自来水清洗干净，然后再用纯水涮洗2次，再放入多彩电泳玻璃板沥水架中自然晾干，或放入37度烘箱中烘干；

2）T-20PLUS制胶仪制胶2块：使用大通量制胶器装配电泳玻璃板2套，按照制胶仪提示灌制2块10%等度胶，并插好电泳梳子待其凝固（约20-30min）;

3）一步法PAGE彩色凝胶超快速配制试剂盒（8%）或一步法免染 PAGE 彩色凝胶超快速配制试剂盒（10%）(仅第二轮实验）制胶2块

装配通用分体式制胶器：每人装配2套玻璃板。将分体式制胶器的制胶夹放在平整的桌面上，将制胶夹上的压板完全打开，插入平玻璃板和凹玻璃板，确保平玻璃板和凹玻璃底端齐平，旋转压板压紧玻璃板，再将制胶夹连同卡紧的玻璃板整体夹入制胶器主体支架；

根据实验需求选择不同浓度的制胶试剂盒（一步法PAGE彩色凝胶超快速配制试剂盒（8%）， 等比例混合溶液A和B，分别配制下层胶溶液、上层胶溶液。不同规格以及不同厚度的玻璃板可以等比例调整上层胶和下层胶溶液的配制体积，以常用规格8.3cm×7.3 cm凝胶板（2块）为例，推荐配制体系如下表格：

表1：一步法制胶组分体系

装配好制胶器后，先灌入配制好（注意加促凝剂并混匀）的下层胶溶液（4.8mL），再立即加入配制好（注意加促凝剂并混匀）的上层胶溶液（加满），立刻插入电泳梳子，待其凝固（约15-30min）；

4）取下制胶器主体，小心拔掉梳子，将凝胶玻璃板从制胶器拆卸，分别装配至垂直电泳仪，再将电泳仪放入电泳槽，内侧加满电泳缓冲液，外侧加一半电泳缓冲液，准备开始点样电泳；

表2：点样顺序（常规点样，4种组织）

点样完成，盖上电泳仪盖子，正确插好电源电极，设置恒压200 V，40分钟（电泳电源，直至溴酚蓝离最底部大约1cm即可终止电泳，准备进行转膜操作。