本方法适用于外周血、骨髓、脾脏、淋巴结、肿瘤组织、培养细胞及其他来源的单细胞悬液。

本方法主要用于细胞表面抗原检测。若检测胞内细胞因子、转录因子、磷酸化蛋白或核内蛋白，应在表面染色后增加相应的固定和破膜步骤。

荧光标记抗体可特异性结合细胞膜表面的目标抗原。染色完成后，细胞依次通过流式细胞仪的激光检测区域，根据细胞的前向散射光、侧向散射光及不同荧光通道信号，对细胞群体进行识别、分群和定量分析。

• 待检测的单细胞悬液。

• 磷酸盐缓冲液，即 PBS。

• 流式染色缓冲液，即 FACS Buffer。

• 推荐配方为：

• PBS 中加入0.5%～1%牛血清白蛋白，或加入5%～10%胎牛血清。

• 根据实验目的可加入0.1%叠氮化钠。

• 如染色后的细胞需要继续培养、进行细胞分选或开展功能实验，则不得加入叠氮化钠，因为叠氮化钠会抑制细胞代谢活性。

• 荧光标记的一抗。

• Fc受体封闭液。

• 活死细胞染料，如7-AAD、PI或可固定型活死细胞染料。

• 1%～4%多聚甲醛固定液，根据实验需要选用。

• 红细胞裂解液，根据样本类型选用。

• 细胞过滤网，推荐孔径为40μm或70μm。

• 流式检测管或96孔圆底板。

• 单染补偿微球，可根据实验需要选用。

• 流式细胞仪。

• 低温离心机。

• 移液器及配套枪头。

• 细胞计数仪或血细胞计数板。

• 生物安全柜。

• 涡旋振荡器。

• 4 ℃冰箱或冰盒。

1. 抗体滴定

正式实验前，应对每种抗体进行滴定，确定能够获得较好阳性、阴性分离效果且背景较低的抗体用量。实际使用时应根据抗体说明书、细胞数量、抗原表达水平及预实验结果进行调整。

2. 荧光搭配

根据流式细胞仪的激光器和滤光片配置选择荧光染料。

高表达抗原可搭配亮度相对较低的荧光染料，低表达抗原则优先搭配亮度较高的荧光染料。

应尽量避免将表达于同一细胞群且荧光信号强度差异较大的抗原安排在串色明显的通道中。

3. 对照设置

完整的流式检测实验至少应设置以下对照：

未染色对照，用于判断细胞自发荧光及设置基础电压。

单染对照，每种荧光染料分别设置一个单染管，用于荧光补偿。

FMO对照，即缺一荧光对照，用于确定弱阳性或连续性表达指标的阳性边界。

活死染料单染对照，用于设置活细胞和死细胞门。

阴性生物学对照或已知阳性对照，根据实验条件设置。

同型对照通常不作为确定阳性界限的首选，仅在评价非特异性抗体结合或验证特殊抗体体系时使用。

1. 培养细胞

收集悬浮细胞或消化贴壁细胞。

贴壁细胞应尽量使用对表面抗原影响较小的消化方式。某些表面抗原可能被胰酶切割，因此需要根据目标抗原选择胰酶、EDTA或非酶细胞解离液。

收集细胞后，以300～500×g离心5 min，弃去上清。

使用预冷的PBS或FACS Buffer洗涤细胞1～2次。

2. 外周血或骨髓样本

根据实验设计，可采用全血染色后裂解红细胞，或先分离外周血单个核细胞后进行染色。

采用全血染色时，应按照红细胞裂解液说明书完成裂解和洗涤。

采用密度梯度离心分离单个核细胞时，应充分洗涤细胞，降低血小板及分离液残留。

3. 组织样本

将组织剪碎后，采用机械研磨或酶消化方法制备细胞悬液。

消化完成后，使用40μm或70μm细胞过滤网过滤。

根据需要进行红细胞裂解。

使用FACS Buffer洗涤细胞1～2次。

4. 细胞计数及活率检测

使用台盼蓝、AO/PI或其他方法进行细胞计数和活率检测。

建议细胞活率不低于90%，最好达到95%左右。

将细胞浓度调整为1×10^6～5×10^6 cells/mL。

每个检测管建议加入1×10^5～1×10^6个细胞。对于稀有细胞群检测，应适当提高起始细胞数量。

1. 分装细胞

每个流式管中加入100 μL细胞悬液。

每管细胞量建议为1×10^5～1×10^6个。

所有样本和试剂应尽量保持低温，除非抗体说明书另有要求。

低温条件有助于减少细胞表面抗原的内化和调节，从而降低荧光信号损失。

2. 活死细胞染色

如使用胺反应型可固定活死染料，应先按照试剂说明书在无蛋白PBS中完成活死染色，再进行抗体染色。

如使用PI或7-AAD等不可固定型染料，一般在上机前加入。

活死染料的使用顺序应以具体产品说明书为准。

3. Fc受体封闭

对于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞及其他高表达Fc受体的细胞，建议进行Fc受体封闭。

向每个样本中加入适量Fc受体封闭液。

4. 配制抗体混合液

按照实验设计，将各荧光标记抗体加入FACS Buffer中配制成抗体混合液。

多色染色时，建议预先配制统一的抗体混合液，以减少不同样本间的移液误差。

抗体混合液应避光、低温保存，并在配制后尽快使用。

5. 表面抗体染色

向各样本中加入相应的抗体混合液，轻轻混匀。

在4 ℃条件下避光孵育20～30 min。

对于部分抗体，也可在室温避光孵育30 min，根据抗体说明书和预实验结果确定。

6. 洗涤

染色结束后，每管加入1～2 mL预冷的FACS Buffer。

以300～500 ×g、4 ℃离心5 min。

弃去上清。

重复洗涤2次。对于背景较高的抗体，可洗涤3次。

7. 未标记一抗的间接染色

若使用未标记一抗，则在一抗孵育和洗涤后，加入经优化稀释的荧光标记二抗。

在4 ℃或室温条件下避光孵育20～30 min。

孵育结束后，用FACS Buffer洗涤2～3次。

最终用200～500 μL预冷的FACS Buffer重悬细胞。

应注意二抗可能识别其他样本抗体，因此多色实验中应谨慎设计间接染色组合。

8. 固定

如样本可立即上机且需要保持细胞活性，可不固定。

如样本不能立即检测，或样本属于人源、感染性或具有潜在生物危害的材料，可进行固定。

加入适量1%～4%多聚甲醛固定液，室温避光孵育10～15 min。

以300～500 ×g离心5 min，弃去固定液。

使用PBS或FACS Buffer洗涤1次，最终用200～500 μL PBS或FACS Buffer重悬。

9. 上机前处理

上机前轻轻吹打或短暂低速涡旋，使细胞充分分散。

如样本中存在明显细胞团块，可再次通过40 μm细胞过滤网过滤。

如使用PI或7-AAD，在上机前按照说明书加入染料，并避光放置。

样本应置于冰上或4 ℃避光保存，并尽快完成检测。

1. 仪器启动

按照仪器标准操作规程完成开机、流路清洗和性能检测。

使用质控微球检查激光器、流路、荧光检测器及信号稳定性。

只有当仪器质控结果符合要求时，方可进行样本检测。

2. 电压设置

首先采集未染色样本。

根据细胞大小和颗粒度调整前向散射光和侧向散射光电压，使主要细胞群位于坐标图合理范围内。

调整各荧光通道电压，使未染色细胞位于阴性区域，同时避免信号贴轴或超出检测范围。

同一批次实验应尽量保持一致的仪器参数。

3. 荧光补偿

分别采集每种荧光染料的单染对照。

单染对照应包含清晰的阳性和阴性群体。

根据单染对照计算不同荧光通道间的串色补偿矩阵。

补偿完成后，应检查阳性群体在非目标通道中是否仍存在明显偏移。

补偿对照应使用与实验样本相同的荧光染料。抗体种类可以不同，但荧光染料必须一致。

4. 样本采集

低速或中速采集样本，避免过高流速造成细胞重叠和信号失真。

普通细胞亚群分析建议每个样本采集不少于10,000～50,000个有效细胞。

对于占比较低的稀有细胞群，应采集100,000个以上有效细胞，具体数量根据目标细胞比例确定。

采集过程中应观察事件速率、流路稳定性及细胞群位置，防止堵管或信号漂移。

1. 去除碎片

使用FSC-A与SSC-A散点图圈定主要细胞群，排除细胞碎片和明显异常事件。

2. 去除双联体和细胞聚集体

使用FSC-A与FSC-H，或FSC-A与FSC-W散点图圈定单细胞群。

必要时可结合SSC-A与SSC-H进一步排除双联体。

3. 圈定活细胞

根据活死染料信号排除死细胞，仅保留活细胞进行后续分析。

死细胞通常具有较强的非特异性抗体结合，若不排除，容易造成假阳性和背景升高。

4. 确定目标细胞群

根据实验目的，使用细胞类型相关的表面标志物逐级圈定目标细胞群。

例如，在免疫细胞分析中，可先圈定CD45阳性细胞，再根据CD3、CD19、CD14、CD56等标志物区分不同免疫细胞亚群。

5. 设置阳性阈值

表达明显、阳性和阴性群体分离良好的指标，可结合阴性群体设置阳性 界限。

对于弱表达或连续性表达指标，应优先依据FMO对照确定阳性门。

不同组样本应采用一致的门控原则，避免人为调整阳性门造成结果偏差。

6. 结果指标

根据实验目的，可报告以下指标：

• 目标细胞群占父群体的百分比。

• 目标抗原阳性细胞比例。

• 平均荧光强度，即MFI。

• 几何平均荧光强度，即gMFI。

• 不同细胞亚群的数量或比例。

• 处理组与对照组之间的表达变化倍数。

建议同时保存原始FCS文件、补偿矩阵、门控模板和最终分析结果。

• 细胞活率原则上应不低于90%。

• 单细胞群边界应清晰，不应存在大量聚集细胞。

• 未染色对照的自发荧光应处于合理范围。

• 单染对照应具有明确的阳性和阴性群体。

• 补偿后，各荧光通道之间不应存在明显过补偿或欠补偿。

• 阴性对照背景应较低。

• 阳性对照应出现预期信号。

• 同批次样本的仪器参数、抗体批次、染色时间和分析门控应保持一致。

• 若样本背景明显升高，应检查细胞活率、Fc受体封闭、抗体浓度、洗涤次数及补偿设置。

• 若荧光信号过弱，应检查抗体活性、抗原表达水平、消化方式、孵育条件及仪器通道设置。

• 所有荧光抗体和染色后的样本均应避光操作。

• 表面染色过程建议在4 ℃进行，以减少抗原内化。

• 不应直接照搬统一的抗体用量，应先进行抗体滴定。

• 细胞离心条件应根据细胞类型调整。脆弱细胞应适当降低离心力。

• 多聚甲醛固定后不可再用于活细胞培养或功能实验。

• 需要进行细胞分选时，缓冲液中不得加入叠氮化钠，也不得进行固定。

• 使用人源样本、感染性材料或未经确认的临床样本时，应按照相应生物安全等级进行操作。

• 染色后应尽量在当天完成检测。原 protocol 同样建议样本尽快上机，并优先在染色当天进行分析。

• 若样本必须延迟检测，应验证固定和保存时间对目标抗原及荧光染料的影响。

• 实验报告中应明确记录样本来源、细胞数量、抗体名称、抗体货号、荧光染料、抗体用量、染色时间、仪器型号、补偿方法及门控策略。

全部事件
→ 排除细胞碎片
→ 单细胞群
→ 活细胞群
→ 目标母细胞群
→ 目标细胞亚群
→ 分析目标表面抗原的阳性率及荧光强度

以上流程构成一套相对完整的细胞表面抗原流式检测实验，包括样本制备、活死染色、Fc受体封闭、表面抗体染色、洗涤、固定、补偿、仪器采集、门控分析和质量控制。