细胞周期检测方法并不少，真正到实验设计这一步，很多人反而容易陷入“该选哪一种”的纠结。结合我们以往的科研实践经验，今天想和大家介绍两种常用的细胞周期检测方法：流式细胞术和BrdU染色，从原理到操作思路做一个简单明了的梳理，帮助科研er更快找到适合自己课题的实验方案。

流式细胞术

一、概述

        流式细胞周期分析是一种通过流式细胞仪来测定细胞内DNA含量，从而判断细胞处于细胞周期哪个阶段的技术。流式细胞术可以快速分析大量细胞，适合于药物筛选中对多个样本进行快速评估。具有较高的敏感性，能够检测到细胞周期的微小变化，有助于评估药物对细胞增殖的影响。这项技术对于研究细胞增殖、细胞周期调控、药物作用效果等方面非常有用。

二、实验材料

        PBS溶液、细胞周期流式检测试剂盒（含RNA酶）、4%多聚甲醛、细胞培养相关耗材、70%乙醇

三、实验方法

        1、收集细胞：根据细胞类型，用胰蛋白酶或其他方法将细胞从培养器皿上收集，并在PBS中洗涤。

        2、细胞固定：在预冷的70%乙醇中固定细胞，通常在4°C下固定30min到过夜。

        3、洗涤细胞：用PBS洗涤细胞2次，去除固定液。

        4、RNA酶处理：加入RNA酶处理细胞，确保只染色DNA而非RNA。

        5、DNA染色：使用PI或其他DNA结合染料对细胞进行染色。PI染料与DNA结合后，其荧光强度与DNA含量成正比。

        6、上机检测：将染色后的细胞通过流式细胞仪进行分析，根据DNA含量的分布情况，将细胞周期区分为G1/G0期，S期和G2/M期，并得出各个时期细胞的百分比。

        7、数据分析：使用Flowjo等分析软件进行数据分析，识别单个细胞、排除细胞碎片和聚集体，最终得到细胞周期分布图。

四、注意事项

        细胞收集和处理过程中要轻柔，避免产生过多的细胞碎片。固定步骤对实验结果至关重要，需要使用预冷的乙醇，并在4°C下进行。实验过程中要避免细胞粘连，确保细胞分散。

细胞周期流式细胞术结果分析图

BrdU染色

一、概述

        BrdU（5-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷）是一种常用于检测细胞增殖的分子标记物。它在DNA合成期（S期）掺入到正在复制的DNA链中，随后可以使用特定的抗BrdU抗体进行检测。BrdU检测广泛应用于细胞生物学、神经科学、肿瘤学等领域，用于研究细胞周期、细胞增殖和DNA修复等过程。此文介绍BrdU在细胞周期检测当中的应用。

二、实验材料

        PBS缓冲液、胰蛋白酶、4%多聚甲醛、细胞培养相关耗材、BrdU溶液、10% PFA储液、10% Saponin储液、固定液、通透液、染色缓冲液、PI染色液

三、实验方法

        1、BrdU掺入：将处于对数生长期的细胞培养液中加入终浓度为10 μM的BrdU。 在5% CO2培养箱中37°C下避光培养60min。同时培养未加入BrdU的细胞作为对照。

        2、终止掺入，收集细胞：吸净含有BrdU的培养液，用PBS清洗细胞两次。用0.05%胰酶消化细胞，得到单细胞悬液收集至15 ml离心管中。离心，弃上清，用1× PBS重悬细胞，调整细胞浓度至约2×10^7细胞/ml。

        3、细胞固定与通透：清洗细胞后，加入固定/通透液，冰上避光孵育30min，清洗细胞，4°C，300×g离心5min，弃上清。

        4、通透：细胞重悬后，加入通透液，室温避光孵育10min。

        5、清洗：加入染色缓冲液，4°C，300×g离心5min，弃上清。

        6、二次固定：重复固定与通透过程，冰上避光孵育30min，清洗细胞。

        7、脱氧核糖核酸酶DNase I处理：细胞重悬后，加入DNase I反应缓冲液和DNase I，37°C水浴锅中避光反应45min。清洗细胞。

        8、一抗标记：小鼠抗BrdU单克隆抗体1:200稀释于染色缓冲液中。细胞重悬后，加入一抗反应液，冰上避光孵育45min，清洗细胞。

        9、荧光二抗标记：Alexa FluorTM488标记的山羊抗小鼠IgG二抗1:500稀释于染色缓冲液中。 细胞重悬后，加入二抗反应液，冰上避光孵育20min，清洗细胞。

        10、核酸染料染色：细胞重悬后，加入染色液，室温避光孵育30min。加入0.5 ml染色缓冲液，样品经200目尼龙网过滤后转移至流式管，放置冰上，等待上机检测。

        11、流式细胞仪分析：使用流式细胞分析仪，根据细胞仪配置和蛋白标记物染色所用的荧光素，设置相应的激光器和采集信号波段。

        12、结果与分析：使用FlowJo软件分析流式细胞仪采集的数据。

四、注意事项
        BrdU检测也存在潜在的问题，如BrdU可能对细胞有一定的毒性，高浓度的BrdU可能影响细胞的正常生长和分裂。此外，BrdU的掺入效率可能受到细胞类型、细胞周期阶段和实验条件的影响。因此，在实验设计时需要仔细考虑这些因素。