真正有说服力的细胞增殖/细胞毒性研究，通常是是围绕实验目的，建立一套彼此补充、互相验证的评价体系。潮新生物围绕这一需求，可提供MTT/CCK-8、台盼蓝染色（细胞计数）、细胞活死染色（荧光/流式）、克隆形成实验以及EdU染色等实验服务，用于从短期活性、细胞存活、增殖状态到长期克隆能力，较系统地评估细胞学表型变化。

 

CCK-8

一、概述

        细胞黏附实验是用来研究细胞与细胞外基质（ECM）之间相互作用的一种实验方法。细胞黏附是细胞生物学中的一个重要过程，它影响细胞的形态、迁移、增殖和分化。

二、实验材料

        PBS溶液、纤连蛋白、96孔板、胰蛋白酶、CCK8试剂盒、BSA、结晶紫、细胞培养相关耗材

三、实验方法

        1、包被培养板：使用10μg/ml的纤连蛋白（或胶原）室温包被96孔板1h。

        2、封闭未结合位点：用热变性的1%BSA在37℃下孵育孔板1h。

        3、洗涤：使用无血清培养基洗涤孔板2次，去除未结合的BSA。

        4、制备细胞悬液：用含EDTA的胰酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，再用无血清培养基洗涤细胞并重悬。

        5、接种细胞：将细胞悬液（通常3-5×10⁴个细胞/孔）铺在预处理好的96孔板中。

        6、培养：将细胞培养箱中培养，时间视不同细胞而定，可能是1h到过夜。

        7、洗去未粘附细胞：用PBS洗3次，去除未粘附的细胞。

        8、细胞粘附检测：使用CCK-8检测试剂盒进行显色，然后用酶标仪在450nm处检测吸光度，从而反应粘附的细胞数。

        9、数据分析：计算细胞粘附率，公式为（粘附细胞OD值/总细胞OD值）×100%。

        注意事项：细胞接种密度不应过大，以避免在检测前细胞长满导致接触抑制。

 

BrdU染色

一、概述

        BrdU（5-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷）是一种常用于检测细胞增殖的分子标记物。它在DNA合成期（S期）掺入到正在复制的DNA链中，随后可以使用特定的抗BrdU抗体进行检测。BrdU检测广泛应用于细胞生物学、神经科学、肿瘤学等领域，用于研究细胞周期、细胞增殖和DNA修复等过程。此文介绍BrdU在细胞周期检测当中的应用。

二、实验材料

        PBS缓冲液、胰蛋白酶、4%多聚甲醛、细胞培养相关耗材、BrdU溶液、10% PFA储液、10% Saponin储液、固定液、通透液、染色缓冲液、PI染色液

三、实验方法

        1、BrdU掺入：将处于对数生长期的细胞培养液中加入终浓度为10 μM的BrdU。 在5% CO₂培养箱中37°C下避光培养60min。同时培养未加入BrdU的细胞作为对照。

        2、终止掺入，收集细胞：吸净含有BrdU的培养液，用PBS清洗细胞两次。用0.05%胰酶消化细胞，得到单细胞悬液收集至15 ml离心管中。离心，弃上清，用1× PBS重悬细胞，调整细胞浓度至约2×10^7细胞/ml。

        3、细胞固定与通透：清洗细胞后，加入固定/通透液，冰上避光孵育30min，清洗细胞，4°C，300×g离心5min，弃上清。

        4、通透：细胞重悬后，加入通透液，室温避光孵育10min。

        5、清洗：加入染色缓冲液，4°C，300×g离心5min，弃上清。

        6、二次固定：重复固定与通透过程，冰上避光孵育30min，清洗细胞。

        7、脱氧核糖核酸酶DNase I处理：细胞重悬后，加入DNase I反应缓冲液和DNase I，37°C水浴锅中避光反应45min。清洗细胞。

        8、一抗标记：小鼠抗BrdU单克隆抗体1:200稀释于染色缓冲液中。细胞重悬后，加入一抗反应液，冰上避光孵育45min，清洗细胞。

        9、荧光二抗标记：Alexa FluorTM488标记的山羊抗小鼠IgG二抗1:500稀释于染色缓冲液中。 细胞重悬后，加入二抗反应液，冰上避光孵育20min，清洗细胞。

        10、核酸染料染色：细胞重悬后，加入染色液，室温避光孵育30min。加入0.5 ml染色缓冲液，样品经200目尼龙网过滤后转移至流式管，放置冰上，等待上机检测。

        11、流式细胞仪分析：使用流式细胞分析仪，根据细胞仪配置和蛋白标记物染色所用的荧光素，设置相应的激光器和采集信号波段。

        12、结果与分析：使用FlowJo软件分析流式细胞仪采集的数据。

        注意事项：BrdU检测也存在潜在的问题，如BrdU可能对细胞有一定的毒性，高浓度的BrdU可能影响细胞的正常生长和分裂。此外，BrdU的掺入效率可能受到细胞类型、细胞周期阶段和实验条件的影响。因此，在实验设计时需要仔细考虑这些因素。

 

EDU染色

一、概述

        EdU实验通常指的是使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）进行的细胞增殖实验。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，可以在DNA复制过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中。EdU的乙炔基可以与荧光或生物素标记的叠氮化物发生共价反应，形成稳定的三唑环，从而通过荧光检测到细胞增殖。这种方法常用于细胞增殖、分化、生长与发育、DNA损伤修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究。相比于BrdU，它的分子量更小，且不需要对DNA进行变性处理，操作更加简便高效。

二、实验材料

        PBS溶液、EdU检测试剂盒、4%多聚甲醛、Triton X-100、细胞核染料如DAPI、6孔板、细胞培养相关耗材

三、实验方法

        1、细胞培养：将细胞接种在6孔培养板上，并培养至对数生长期。

        2、EdU标记：在细胞培养基中加入EdU（通常浓度为10μM），并继续培养2-4h，具体时间取决于细胞类型和生长速度。对于增殖速度比较快的细胞，标记时间可以缩短，反之则延长。

        3、细胞固定：每孔加入1mL的4%的多聚甲醛固定液固定细胞，通常室温下固定15min，固定后用PBS清洗3次。

        4、透膜处理：加入含有Triton X-100的渗透剂处理细胞，以增加细胞膜的通透性，通常室温下处理10-15min，用PBS清洗3次。

        5、EDU点击反应：使用点击反应试剂与EDU发生化学反应，形成可检测的荧光信号。点击反应试剂通常是含有Azide基团的染料。

        6、细胞核染色：使用DAPI染料对细胞核进行染色，以便在荧光显微镜下观察。

        7、荧光显微镜检测：在荧光显微镜下观察并计数EdU阳性细胞，以评估细胞的增殖情况。

        8、数据分析：对获得的图像进行分析，计算EdU阳性细胞的比例，从而得到细胞的增殖率。

        注意事项：在进行EdU实验时，需要注意避免光敏性的EdU受到光线照射。不同的细胞EdU的使用浓度和孵育时间有所不同，需要预实验摸索条件。

 

克隆形成

一、概述

        平板克隆实验是一种用于检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等特性的实验方法。它可以用来评估细胞的群体依赖性和增殖能力。

二、实验材料

        PBS溶液、结晶紫、4%多聚甲醛、6孔培养板、细胞培养相关耗材

三、实验方法

        1、细胞准备：取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，悬浮在完全培养基中，并进行计数。

        2、细胞接种：将细胞接种在6孔板中，根据细胞生长特性，每孔或每皿接种一定数量的细胞，一般是单孔500左右（不同细胞种类大致范围在每孔400-1000个细胞）。

        3、培养：将细胞置于37℃、5% CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养，直到大多数单个克隆中的细胞数大于50。

        4、换液：每隔3天进行换液，并观察细胞状态。

        5、固定和染色：克隆形成后，用PBS洗涤，然后用4%多聚甲醛固定，接着用结晶紫染液染色。

        6、计数和分析：在显微镜下计数克隆形成的数量，计算克隆形成率，公式为：克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%。

        注意事项：细胞悬液的制备和接种密度非常关键，细胞需要均匀分散，避免细胞团的形成。接种密度不能过大，以确保细胞有足够的空间生长。染色完成后，需要将染液清洗干净，避免残留。

 

Ki-67免疫染色

一、概述

        Ki-67染色在肿瘤学研究中尤为重要，因为它可以帮助评估肿瘤细胞的增殖活性，从而对肿瘤的恶性程度和预后进行评估。Ki-67是一种核蛋白，其表达与细胞周期密切相关，因此常用作细胞增殖的标记物。在免疫染色中，Ki-67主要定位于细胞核。

二、实验材料

        PBS溶液、Ki-67染色抗体、4%多聚甲醛、细胞培养相关耗材、二抗、细胞核染料DAPI、封闭液、Tris-EDTA缓冲液

三、实验方法

        1、细胞准备：取细胞样本，用胰蛋白酶处理使细胞从培养器皿上脱离，然后进行固定。固定通常使用4%的多聚甲醛(PFA)进行，固定时间一般为20min。

        2、洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的培养基和未结合的蛋白质。

        3、封闭：使用封闭液（如蛋白块或者牛奶）封闭非特异性结合位点，防止抗体的非特异性结合。

        4、抗原修复：对于甲醛固定的样本，需要进行抗原修复以暴露Ki-67抗原位点，通常使用柠檬酸钠缓冲液或Tris-EDTA缓冲液在高温下修复。

        5、一抗孵育：加入Ki-67特异性的一抗，孵育一段时间使抗体与抗原充分结合。

        6、洗涤：再次使用PBS洗涤，去除未结合的一抗。

        7、二抗孵育：加入荧光标记的二抗，孵育后与一抗结合，形成抗原-一抗-二抗复合物。

        8、核染色：使用DAPI等核染料对细胞核进行染色。

        9、洗涤和封片：最后一次洗涤后，使用抗荧光淬灭液封片，防止荧光衰减。

        10、荧光显微镜观察：在荧光显微镜下观察，Ki-67阳性的细胞会显示特定的荧光信号，而细胞核则显示为蓝色。

        注意事项：确保样本中含有增殖分裂旺盛的组织，以便获得更好的实验结果。使用阳性对照，如扁桃体组织，以确保实验的有效性。避免样本干燥，这对保持细胞形态和抗原的可检测性至关重要。适当优化抗原修复条件，这对获得高质量的染色结果至关重要。

 

细胞活死染色

一、概述

        细胞活死染色是一种用于区分活细胞和死细胞的实验技术，它基于活细胞和死细胞对特定染料的亲和力差异，利用染料与细胞内的不同成分发生特异性反应，使这些成分在显微镜下呈现出不同颜色和形态。这项技术在生物学、医学等领域的研究中具有广泛的应用价值。活细胞的细胞膜是完整的，具有选择透过性，能够控制物质进出细胞。而死细胞的细胞膜受损，失去了其完整性，导致物质可以自由地进出细胞。活死染色中使用的染料通常包括活细胞染料和死细胞染料。活细胞染料（如荧光素类染料）由于活细胞膜的屏障作用，不能自由进入活细胞内部，或者即使能进入，也会被活细胞内的酶分解或排出。而死细胞染料（如碘化丙啶PI）则能够穿透死细胞或受损细胞的细胞膜，与细胞内的DNA或RNA结合，从而发出荧光。

二、实验材料

        PBS溶液、活死染料（Calcein AM/PI染液）、4%多聚甲醛、细胞培养相关耗材

三、实验方法

        1、准备细胞：如果是贴壁细胞，先将细胞培养在适当的培养皿或培养瓶中，待细胞生长到合适密度后，进行后续操作。如果是悬浮细胞，则直接从培养液中收集细胞。

        2、洗涤细胞：移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞1 - 2次，以去除残留的培养基和血清。

        3、配制染色工作液：根据所使用的活死细胞染色试剂盒中的说明，配制适当浓度的活细胞染料（如Calcein AM）和死细胞染料（如碘化丙啶PI）的工作液。

        4、染色：将清洗过的细胞与配制好的染色工作液混合，确保染料均匀覆盖细胞。在室温下避光孵育一定时间（通常为20min），使染料充分进入细胞并与目标物质结合。

        5、再次清洗：孵育完成后，用PBS再次清洗细胞，以去除未结合的染料和背景干扰。

        6、观察：使用荧光显微镜或流式细胞仪等仪器观察细胞。活细胞会发出绿色荧光，而死细胞会发出红色荧光。

        注意事项：活死染色的结果可能受到操作技巧的影响，如细胞密度、染色液浓度、孵育时间的控制不当可能导致染色不均匀。