外关于FCM-DNA倍体分析的质量控制仍没有一个统一的标准，导致各文献报道的实验结果差异较大，这给进一步深入研究和交流造成很大的困难。1992年10月美国国立癌症研究所组织召开了FCM-DNA定量分析统一标准的国际学术会议，在这次会议上制定了FCM-DNA测定的统一标准。以下拟就这些标准结合本实验室经验对FCM-DNA的质量控制和影响因素做重点阐述。

1. 标本采集和固定方法的质控

标本采集质量直接影响流式DNA检测的准确度和实验结果。因此，在标本采集时应注意：

① 手术新鲜标本取材，要避开出血、坏死组织；

② 标本采集后应及时送检，或及时固定或深低温保存，以免组织自溶、DNA降解；

③ 固定剂要选择对组织穿透力强的浓度，如用浓度超过75%的乙醇固定易导致细胞表面快速形成一个蛋白质膜，使细胞内物质固定不良而发生自溶，常出现假异倍体。

2. 单细胞悬液制备的质控

合格的单细胞悬液是流式DNA分析能否成功的关键。对单细胞悬液制备的质控要求如下：

① 人外周血细胞、骨髓细胞、淋巴细胞是天然的单个分散细胞，是最适合用于流式分析的样品；

② 新鲜实体组织单细胞样品制备。目前还没有既合适又通用的方法，含大量结缔组织的组织块，宜选择胶原酶消化分散细胞；化学方法往往与酶学法联合应用；机械法碎片多，细胞损伤大；低渗法细胞核易自行释放出来，可获得较小变异系数的样品，但要防止低渗过度致核碎片增多。

3. 石蜡包埋组织单细胞悬液制备的质控

用于蜡组织检测细胞DNA含量是细胞学技术的重要进展之一。石蜡包埋组织单细胞悬液制备的质控要求如下：

① 选择无自溶坏死组织、肿瘤细胞丰富的区域；

② 切取40～50mm厚度切片，过厚消化费时，过薄则碎片多，仪器噪声增加，DNA直方图基线抬高，检出异倍体减少；

③ 组织脱蜡时要脱净，是否脱净的检查方法是弃去二甲苯，加入100%乙醇，无絮状物浮起则蜡已脱净；

④ 用梯度乙醇水化要充分；

⑤ 消化酶浓度、pH值、温度要适当。

此法尚存在以下问题：

a. 样品碎片多，CV值大，DNA直方图质量差；

b. 异倍体率下降，近二倍体被掩盖；

c. S期细胞百分比不精确，偏高；

d. DNA二倍体标准不稳定。

4. 脱落细胞样品的采集

胸腹腔积液、内镜刷检细胞、膀胱冲洗液等检测的流式DNA倍体分析结果易出现阴性和假阳性。因为细胞数量太少，一般很难达到10⁶个/mL。

5. 细胞悬液荧光染色的质控

样品荧光染色对流式定量分析的准确度十分重要。在染色时应特别注重染料的特性及量效关系。

常见荧光染色的影响因素主要包括以下几点：温度要合适，防止温度过高，最好在20℃以下；染液浓度与荧光发射强度成正比，要防止温度过高发生的浓度猝灭现象；pH值对荧光发射强度有明显影响，每种染料都有自己的合适pH值。

6. 流式细胞仪操作技术质控

仪器的线性好坏会对细胞定量分析的准确度产生显著影响，尤其对细胞周期DNA分布影响十分明显。仪器的CV值越小越好，一般应在2%以下。

7. 流式细胞分析资料处理的质控

流式细胞分析资料处理原则：

① 样品中杂质、碎片过多，细胞成分仅占20%以下时，DNA直方图基线抬高，不能进行细胞周期分析。

② 分析细胞数应在1万以上（不包括碎片、杂质及团块细胞），如果只做DNA倍体分析，小于1万也可以。当DNA异倍体细胞占10%以下时，得出结论要慎重。

③ 正常二倍体细胞的CV值大于8%时，应放弃分析。

④ 正常人不同组织的DNA含量可以有10%的漂移；S期细胞准确检测主要靠非DNA含量检测法，包括PCNA、CD71、BrdU等方法。

⑤ DNA倍体参考标准的质控：DNA倍体分析标准是根据正常二倍体DNA含量分布范围来确定的，采用同源正常组织、同种固定方法及处理方法，同步染色及在同样仪器条件下，以正常二倍体细胞作为内标准；也可以用人体恶性肿瘤组织中的正常二倍体细胞作为内标准，包括同源正常组织、血管、包膜组织及浸润淋巴细胞、巨噬细胞等。这种方法比前者更方便和准确，但仅适用于实体肿瘤组织，不适用于细胞株分析。

⑥ 假性异倍体的识别与排除：假性异倍体多出现在近二倍体肿瘤或DNA指数小于1.3的异倍体中。假性异倍体出现的原因：组织自溶；组织固定之前或固定期间（而非降解阶段）细胞DNA出现变性，染色质结构发生变化，与荧光染料结合增加或减少。在异倍体细胞数仅占测量细胞总数5%～10%的情况下，可以再行检测，若仍然出现异倍体峰，才可能为真正的异倍体峰，否则为假性异倍体。

8. 定量荧光细胞染色技术的评价标准

定量荧光细胞染色技术的评价标准应考虑：

① 特异性荧光染料是否与所研究的细胞成分为特异性结合；

② 在相同的实验条件下，荧光强度与所研究的细胞生化成分是否具有一定的定量关系；

③ 使用荧光显微镜检查，荧光的分布是否具有一个核形态结构，荧光分布是否一致，可否看到一些粗大的荧光颗粒；

④ 用流式细胞仪分析评价，在DNA直方图上，DNA含量的第一个峰（G₀/G₁期细胞）与第二个峰（G₂/M期细胞）是否成倍数关系。