一、概述

线粒体膜电位检测是一种常用的生物学实验方法，用于评估线粒体的功能状态。线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential，简称ΔΨm）是线粒体正常功能的关键指标，其下降通常是细胞凋亡早期的一个重要标志。线粒体膜电位的检测通常使用荧光探针，如JC-1，它能够根据线粒体膜电位的变化而改变其荧光特性。JC-1在膜电位高时形成聚合物，发出红色荧光。JC-1在膜电位低时为单体，发出绿色荧光。

二、实验材料

PBS溶液、JC-1试剂盒、胰蛋白酶、细胞培养相关耗材

三、实验方法

1、JC-1染色工作液的配制：六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1mL，其他培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每50～100万细胞需0.5mL JC-1染色工作液。

取适量JC-1（200×），按照每50μL JC-1（200×）加入8mL超纯水的比例稀释JC-1。

剧烈震荡充分溶解并混匀JC-1，然后再加入2mL JC-1染色缓冲液（5×），混匀后即为JC-1染色工作液。

2、阳性对照的设置：把试剂盒中提供的CCCP（10mM）推荐按照1∶1000的比例加入到细胞培养液中，稀释至10μM，处理细胞20min。

随后按照下述方法装载JC-1，进行线粒体膜电位的检测。

3、对于悬浮细胞：

（1）取10～60万细胞，重悬于0.5mL细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

（2）加入0.5mL JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20min。

（3）在孵育期间，按照每1mL JC-1染色缓冲液（5×）加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液（1×），并放置于冰浴。

（4）37℃孵育结束后，600g 4℃离心3～4min，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。

（5）用JC-1染色缓冲液（1×）洗涤2次：加入1mL JC-1染色缓冲液（1×）重悬细胞，600g 4℃离心3～4min，沉淀细胞，弃上清。再加入1mL JC-1染色缓冲液（1×）重悬细胞，600g 4℃离心3～4min，沉淀细胞，弃上清。

（6）再用适量JC-1染色缓冲液（1×）重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

4、对于贴壁细胞：

（1）对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其他适当溶液洗涤细胞一次，加入1mL细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

（2）加入1mL JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20min。

（3）在孵育期间，按照每1mL JC-1染色缓冲液（5×）加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液（1×），并放置于冰浴。

（4）37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液（1×）洗涤2次。

（5）加入2mL细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。

（6）荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

5、对于纯化的线粒体：

（1）把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色缓冲液（1×）稀释5倍。

（2）0.9mL 5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1mL 总蛋白量为10～100μg纯化的线粒体。

（3）用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描（time scan），激发波长为485nm，发射波长为590nm。

6、荧光观测和结果分析：

检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。

注意事项：JC-1（200×）在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20～25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。必须先把JC-1（200×）用试剂盒提供的超纯水充分溶解混匀后，才可以加入JC-1染色缓冲液（5×）。