一、概述

鬼笔环肽（Phalloidin）是一种从毒蕈类鬼笔鹅膏（Amanita phalloides）中提取的环状七肽毒素。能够以高亲和力（Kd= 20 nM）选择性地结合到丝状肌动蛋白（F-actin），而不会与单体肌动蛋白（G-actin）结合。鬼笔环肽衍生物可以被荧光标记，如TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）标记，使其能够用于荧光显微镜下的观察，从而对F-actin进行定性和定量分析。

二、实验材料

PBS溶液、TRITC标记鬼笔环肽、胰蛋白酶、4%多聚甲醛、 Triton X-100、细胞培养相关耗材

三、实验方法

1、细胞接种：细胞爬片生长>24h，使其密度达到50-60%汇合度。

2、清洗：吸掉培养液，37℃预热的1×PBS（pH 7.4）清洗细胞2次。

3、固定：使用溶于PBS的4%多聚甲醛溶液进行细胞固定，室温固定10-30min。

4、清洗：室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10min。

5、透化：室温条件下，用丙酮（≤-20℃）脱水或者用0.5% Triton X-100溶液透化处理5min。

室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10min。

6、染色：取100µl/孔（96孔板）配制好的TRITC标记鬼笔环肽工作液，覆盖住盖玻片上的细胞，室温避光孵育30分钟。用PBS清洗盖玻片3次，每次5min。

7、细胞核染色：使用100µl/孔（96孔板）即用型DAPI溶液（浓度：100 nM）对细胞核进行复染，约30秒。

8、封片：用PBS清洗盖玻片，然后倒置在已经滴有一滴Fluoromount-G水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封片剂，然后用指甲油永久封片。

9、显微镜成像：荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，选择TRITC激发/发射滤片（Ex/Em=540/570nm）和DAPI激发/发射滤片（Ex/Em=364/454nm）

注意事项：避免使用含有甲醇的固定剂，因为甲醇可能会破坏肌动蛋白。