一、概述

细胞活死染色是一种用于区分活细胞和死细胞的实验技术，它基于活细胞和死细胞对特定染料的亲和力差异，利用染料与细胞内的不同成分发生特异性反应，使这些成分在显微镜下呈现出不同颜色和形态。这项技术在生物学、医学等领域的研究中具有广泛的应用价值。活细胞的细胞膜是完整的，具有选择透过性，能够控制物质进出细胞。而死细胞的细胞膜受损，失去了其完整性，导致物质可以自由地进出细胞。 活死染色中使用的染料通常包括活细胞染料和死细胞染料。活细胞染料（如荧光素类染料）由于活细胞膜的屏障作用，不能自由进入活细胞内部，或者即使能进入，也会被活细胞内的酶分解或排出。而死细胞染料（如碘化丙啶PI）则能够穿透死细胞或受损细胞的细胞膜，与细胞内的DNA或RNA结合，从而发出荧光。

二、实验材料

PBS溶液、活死染料（Calcein AM/PI染液）、4%多聚甲醛、细胞培养相关耗材

三、实验方法

1、准备细胞：如果是贴壁细胞，先将细胞培养在适当的培养皿或培养瓶中，待细胞生长到合适密度后，进行后续操作。如果是悬浮细胞，则直接从培养液中收集细胞。

2、洗涤细胞：移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞1 - 2次，以去除残留的培养基和血清。

3、配制染色工作液：根据所使用的活死细胞染色试剂盒中的说明，配制适当浓度的活细胞染料（如Calcein AM）和死细胞染料（如碘化丙啶PI）的工作液。

4、染色：将清洗过的细胞与配制好的染色工作液混合，确保染料均匀覆盖细胞。在室温下避光孵育一定时间（通常为20min），使染料充分进入细胞并与目标物质结合。

5、再次清洗：孵育完成后，用PBS再次清洗细胞，以去除未结合的染料和背景干扰。

6、观察：使用荧光显微镜或流式细胞仪等仪器观察细胞。活细胞会发出绿色荧光，而死细胞会发出红色荧光。

注意事项：活死染色的结果可能受到操作技巧的影响，如细胞密度、染色液浓度、孵育时间的控制不当可能导致染色不均匀。