一、概述

BrdU（5-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷）是一种常用于检测细胞增殖的分子标记物。它在DNA合成期（S期）掺入到正在复制的DNA链中，随后可以使用特定的抗BrdU抗体进行检测。BrdU检测广泛应用于细胞生物学、神经科学、肿瘤学等领域，用于研究细胞周期、细胞增殖和DNA修复等过程。此文介绍BrdU在细胞周期检测当中的应用。

二、实验材料

PBS缓冲液、胰蛋白酶、4%多聚甲醛、细胞培养相关耗材、BrdU溶液、10% PFA储液、10% Saponin储液、固定液、通透液、染色缓冲液、PI染色液

三、实验方法

1、BrdU掺入：将处于对数生长期的细胞培养液中加入终浓度为10 μM的BrdU。 在5% CO2培养箱中37°C下避光培养60min。同时培养未加入BrdU的细胞作为对照。

2、终止掺入，收集细胞：吸净含有BrdU的培养液，用PBS清洗细胞两次。用0.05%胰酶消化细胞，得到单细胞悬液收集至15 ml离心管中。离心，弃上清，用1× PBS重悬细胞，调整细胞浓度至约2×10^7细胞/ml。

3、细胞固定与通透：清洗细胞后，加入固定/通透液，冰上避光孵育30min，清洗细胞，4°C，300×g离心5min，弃上清。

4、通透：细胞重悬后，加入通透液，室温避光孵育10min。

5、清洗：加入染色缓冲液，4°C，300×g离心5min，弃上清。

6、二次固定：重复固定与通透过程，冰上避光孵育30min，清洗细胞。

7、脱氧核糖核酸酶DNase I处理：细胞重悬后，加入DNase I反应缓冲液和DNase I，37°C水浴锅中避光反应45min。清洗细胞。

8、一抗标记：小鼠抗BrdU单克隆抗体1:200稀释于染色缓冲液中。细胞重悬后，加入一抗反应液，冰上避光孵育45min，清洗细胞。

9、荧光二抗标记：Alexa FluorTM488标记的山羊抗小鼠IgG二抗1:500稀释于染色缓冲液中。 细胞重悬后，加入二抗反应液，冰上避光孵育20min，清洗细胞。

10、核酸染料染色：细胞重悬后，加入染色液，室温避光孵育30min。加入0.5 ml染色缓冲液，样品经200目尼龙网过滤后转移至流式管，放置冰上，等待上机检测。

11、流式细胞仪分析：使用流式细胞分析仪，根据细胞仪配置和蛋白标记物染色所用的荧光素，设置相应的激光器和采集信号波段。

12、结果与分析：使用FlowJo软件分析流式细胞仪采集的数据。

注意事项：BrdU检测也存在潜在的问题，如BrdU可能对细胞有一定的毒性，高浓度的BrdU可能影响细胞的正常生长和分裂。此外，BrdU的掺入效率可能受到细胞类型、细胞周期阶段和实验条件的影响。因此，在实验设计时需要仔细考虑这些因素。