一、概述

Ki-67染色在肿瘤学研究中尤为重要，因为它可以帮助评估肿瘤细胞的增殖活性，从而对肿瘤的恶性程度和预后进行评估。Ki-67是一种核蛋白，其表达与细胞周期密切相关，因此常用作细胞增殖的标记物。在免疫染色中，Ki-67主要定位于细胞核。

二、实验材料

PBS溶液、Ki-67染色抗体、4%多聚甲醛、细胞培养相关耗材、二抗、细胞核染料DAPI、封闭液、Tris-EDTA缓冲液

三、实验方法

1、细胞准备：取细胞样本，用胰蛋白酶处理使细胞从培养器皿上脱离，然后进行固定。固定通常使用4%的多聚甲醛(PFA)进行，固定时间一般为20min。

2、洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的培养基和未结合的蛋白质。

3、封闭：使用封闭液（如蛋白块或者牛奶）封闭非特异性结合位点，防止抗体的非特异性结合。

4、抗原修复：对于甲醛固定的样本，需要进行抗原修复以暴露Ki-67抗原位点，通常使用柠檬酸钠缓冲液或Tris-EDTA缓冲液在高温下修复。

5、一抗孵育：加入Ki-67特异性的一抗，孵育一段时间使抗体与抗原充分结合。

6、洗涤：再次使用PBS洗涤，去除未结合的一抗。

7、二抗孵育：加入荧光标记的二抗，孵育后与一抗结合，形成抗原-一抗-二抗复合物。

8、核染色：使用DAPI等核染料对细胞核进行染色。

9、洗涤和封片：最后一次洗涤后，使用抗荧光淬灭液封片，防止荧光衰减。

10、荧光显微镜观察：在荧光显微镜下观察，Ki-67阳性的细胞会显示特定的荧光信号，而细胞核则显示为蓝色。

注意事项：确保样本中含有增殖分裂旺盛的组织，以便获得更好的实验结果。使用阳性对照，如扁桃体组织，以确保实验的有效性。避免样本干燥，这对保持细胞形态和抗原的可检测性至关重要。适当优化抗原修复条件，这对获得高质量的染色结果至关重要。