做Western Blot时，目标条带浅得几乎看不清，令人非常头疼。

我们的第一反应考虑：是不是抗体加少了？下次把一抗浓度提高一倍，条带应该就会变深吧。

这个思路有一定道理，但不能万能的，今天我们为大家从样本、上样、电泳、转膜、封闭、抗体孵育和显影等多个环节分析，WB条带信号低的新出现原因。

一、增加抗体浓度，什么时候真的有用？

当样本中确实含有目标蛋白，电泳和转膜也基本正常，但抗体与目标蛋白结合产生的信号不足时，适当提高抗体浓度通常会有帮助。

1. 一抗稀释比例过高

例如抗体说明书推荐稀释范围为1:500～1:2000，实验中直接使用了1:5000，抗体量可能不足以识别膜上的目标蛋白。

这时可以将一抗浓度逐步提高，例如：

• 1:5000调整为1:2000；
• 1:2000调整为1:1000；
• 1:1000调整为1:500。

不建议一次把浓度提高太多。浓度变化过大，容易同时带来高背景和非特异性条带，很难判断到底是哪一步起了作用。

2. 目标蛋白表达量较低

转录因子、磷酸化蛋白、膜蛋白及部分低丰度信号通路蛋白，本身表达量就比较低。

在样本质量和转膜效果正常的情况下，可以适当提高一抗浓度，或者延长一抗孵育时间，让抗体与目标蛋白充分结合。

常见优化方式包括：

• 一抗由室温孵育1～2小时，调整为4℃孵育过夜；
• 适当提高一抗浓度；
• 使用灵敏度更高的ECL发光液；
• 增加曝光时间，但避免过度曝光。

3. 抗体效价下降

抗体反复冻融、保存时间过长、保存温度不稳定，都可能导致抗体活性下降。

这种情况下，提高抗体浓度可能暂时改善信号，但效果往往有限。如果同一抗体以前能够正常出条带，近期却明显变浅，需要优先检查抗体保存情况。

建议一抗到货后及时分装，减少反复冻融，并按照说明书要求保存。

二、哪些情况下，提高抗体浓度基本没用？

如果条带浅的根本原因不在抗体，提高浓度通常解决不了问题。

1. 样本中目标蛋白含量太低

如果样本本身几乎不表达目标蛋白，抗体浓度再高，也没有足够的目标蛋白可以结合。

例如研究药物处理后某蛋白表达下降，处理组条带明显变浅，可能正是实验结果，而不一定是实验失败。

建议设置阳性对照。阳性对照能够正常出带，实验组条带较浅，通常提示样本表达量较低；阳性对照同样没有条带，则需要继续排查实验流程。

2. 蛋白发生降解

蛋白提取后未及时置于冰上、未加入蛋白酶抑制剂、样本反复冻融，都可能造成目标蛋白降解。

此时可能出现：

• 目标条带明显变浅；
• 目标分子量附近没有完整条带；
• 出现多个低分子量杂带；
• 内参条带也不稳定。

增加抗体浓度只能同时放大这些降解片段，无法恢复已经被破坏的目标蛋白。

3. 上样量不足

如果每个泳道只上了很少量的总蛋白，膜上的目标蛋白自然偏少。

对于大多数常规蛋白，可以先尝试每孔上样20～40 μg总蛋白。低丰度蛋白可能需要适当增加上样量，但也不能无限增加。

上样量过高可能导致条带拖尾、泳道拥挤、背景增加，甚至影响蛋白正常迁移。

4. 转膜不充分

这是条带浅时非常容易被忽略的问题。

高分子量蛋白转膜时间不足、转膜电流偏低、凝胶浓度过高，都可能导致蛋白留在胶内；小分子量蛋白转膜时间过长，则可能直接穿过膜。

判断转膜效果，可以观察：

• 预染蛋白Marker是否完整转移到膜上；
• 转膜后凝胶中是否仍残留明显蛋白；
• Ponceau S染色是否能够看到清晰、均匀的总蛋白条带；
• 膜与凝胶之间是否存在气泡。

如果Ponceau S染色已经很浅，提高抗体浓度通常意义不大，应先解决转膜问题。

5. 二抗或显影系统存在问题

一抗浓度合适，也不代表最终一定有信号。

二抗种属不匹配、二抗稀释过度、HRP失活、ECL发光液过期或曝光设置不合适，都可能造成条带偏浅。

例如一抗来源于兔，二抗却误用了抗小鼠二抗，增加一抗浓度不会带来任何改善。

三、条带浅时，应该按照什么顺序排查？

 

第一步：查看内参条带

如果目标蛋白和内参都很浅，优先考虑：

• 蛋白定量是否准确；
• 上样量是否不足；
• 转膜是否异常；
• 二抗或发光液是否失效；
• 成像仪参数是否设置不当。

如果内参清晰，只有目标蛋白较浅，则更可能与目标蛋白表达量、一抗浓度或抗体特异性有关。

第二步：检查Ponceau S染色或预染Marker

总蛋白染色均匀、Marker转移正常，说明转膜过程基本可靠。

如果总蛋白染色明显偏浅或局部缺失，先排查转膜夹层、气泡、电流、时间和缓冲液，暂时不要急着加抗体。

第三步：确认抗体信息

重点检查：

• 抗体是否适用于Western Blot；
• 抗体识别的物种是否与样本一致；
• 目标蛋白理论分子量是否正确；
• 一抗和二抗种属是否匹配；
• 抗体说明书推荐稀释比例是多少；
• 抗体是否经历多次冻融。

有些抗体能够用于免疫荧光或免疫组化，并不一定适合Western Blot。购买或使用前，需要确认抗体应用范围。

第四步：进行梯度实验

如果前面几项都没有明显问题，可以设置一抗浓度梯度。

例如同时测试：

• 1:500；
• 1:1000；
• 1:2000。

其他实验条件保持一致，比较目标条带强度、背景和杂带数量。

最佳抗体浓度并不是条带越深越好，而是在目标条带清晰的同时，背景较低、杂带较少。

四、增加一抗浓度，还是增加二抗浓度？

一般优先优化一抗浓度。

一抗直接决定对目标蛋白的识别能力。如果一抗浓度不足，提高一抗浓度往往更有效。

二抗主要负责放大信号。二抗浓度过低时，可以适当提高；但二抗过浓更容易带来整张膜背景发黑、非特异性信号增加等问题。

如果目标条带和背景一起变深，说明提高二抗浓度没有真正改善信噪比。

常规实验中，可以参考以下范围进行梯度测试：

• 一抗：1:500～1:2000；
• HRP标记二抗：1:5000～1:20000。

具体比例仍需结合抗体说明书、目标蛋白丰度和显影系统灵敏度确定。

五、比增加抗体浓度更有效的优化方法

对于低丰度蛋白，除了增加抗体浓度，还可以从以下方向提高检测灵敏度。

1. 增加有效上样量

在泳道承载能力允许的范围内，适当增加总蛋白上样量。

如果目标蛋白只在特定细胞组分中表达，也可以进行核蛋白、膜蛋白或胞浆蛋白提取，减少无关蛋白对目标信号的稀释。

2. 优化转膜条件

高分子量蛋白可以适当：

• 延长转膜时间；
• 降低甲醇比例；
• 在转膜液中加入少量SDS；
• 使用孔径为0.45 μm的PVDF膜。

小分子量蛋白可以适当：

• 缩短转膜时间；
• 降低电流；
• 使用孔径为0.22 μm的膜；
• 避免SDS浓度过高。

3. 延长一抗孵育时间

4℃孵育过夜通常比室温短时间孵育更有利于低丰度蛋白检测，同时也有助于提高特异性。

4. 更换高灵敏度发光液

普通ECL无法显示低丰度目标时，可以更换为高灵敏度或超高灵敏度ECL。

不过，发光液越灵敏，背景和杂带也越容易被放大，需要同步优化抗体浓度和洗膜条件。

5.延长洗膜时间

提高抗体浓度后，建议适当增加TBST洗膜次数或延长洗膜时间。

例如每次洗膜由5分钟调整为10分钟，共洗3次，有助于去除未结合的抗体，降低背景。