一个完整的蛋白提取流程通常包括：

样品准备 → 裂解处理 → 蛋白释放 → 离心分离 → 蛋白定量 → 分装保存

下面以常见细胞和动物组织蛋白提取流程为例，介绍蛋白样品提取的关键步骤。

一、样品准备

蛋白提取的第一步是样品准备。

对于细胞样品，需要收集足量细胞并充分去除培养基残留；对于动物组织样品，需要根据实验目的选择目标组织区域，并尽快进行处理或低温保存。

样品处理过程中，应尽量减少蛋白降解。

正确操作：

样品收集后及时进行低温处理，避免长时间暴露于室温环境；对于暂时无法处理的样品，应进行规范保存，减少反复冻融。

常见避坑：

❌ 样品收集后长时间放置，再进行蛋白提取。

蛋白酶在离开细胞环境后会迅速影响蛋白稳定性，导致目标蛋白降解，最终表现为WB条带减弱甚至消失。

二、根据实验目的选择合适裂解液

裂解液的作用是破坏细胞结构，使蛋白释放出来。

不同实验目的需要选择不同裂解体系。

例如：

RIPA裂解液适用于大多数总蛋白提取；

温和裂解体系适用于蛋白互作等研究；

强裂解体系适用于需要充分释放蛋白的实验。

正确操作：

根据目标蛋白性质选择合适裂解体系，并根据样品类型优化裂解条件。

例如：

膜蛋白、核蛋白等特殊蛋白，通常需要针对性优化裂解方案。

常见避坑：

❌ 所有样品都使用同一种裂解液。

不同蛋白定位和结构特点差异明显，简单套用裂解条件可能造成目标蛋白提取效率不足。

三、样品裂解

加入裂解液后，需要使样品充分裂解。

细胞样品通常较容易裂解，而动物组织由于具有细胞外基质和复杂结构，需要结合机械破碎等方式提高蛋白释放效率。

正确操作：

保证样品与裂解液充分接触，使蛋白充分释放，同时控制处理过程中的温度变化。

常见避坑：

❌ 裂解时间不足。

裂解不充分会导致蛋白释放量不足，使检测结果偏低。

❌ 过度处理样品。

过强的机械作用可能导致蛋白结构改变，同时增加蛋白降解风险。

四、离心分离

裂解完成后，需要通过离心去除细胞碎片、不溶性杂质等，获得蛋白上清液。

高质量蛋白样品应保持澄清，避免大量杂质影响后续检测。

正确操作：

离心后取上清液进行后续蛋白定量或保存。

常见避坑：

❌ 吸取沉淀区域。

沉淀中可能含有细胞碎片和未完全裂解物，会影响蛋白浓度检测以及电泳效果。

五、蛋白定量要保证上样一致性

蛋白定量是Western Blot实验中非常重要的一步。

只有保证不同样品蛋白量一致，才能准确比较目标蛋白表达差异。

常用方法包括BCA法、Bradford法等。

正确操作：

完成蛋白浓度测定后，根据实验设计调整样品浓度，使不同组样品保持一致。

常见避坑：

❌ 不进行蛋白定量，直接按照体积上样。

不同样品蛋白浓度可能存在明显差异，会导致条带强弱无法真实反映蛋白表达变化。

六、蛋白保存要减少反复冻融

蛋白提取完成后，需要合理保存，避免样品质量下降。

正确操作：

根据实验安排进行分装保存，实验时取用对应份量。

常见避坑：

❌ 同一管蛋白反复冻融。

反复冻融会影响部分蛋白稳定性，尤其是低丰度蛋白和修饰蛋白。

蛋白样品提取看似简单，但每一步都会影响最终实验结果。

从样品处理、裂解条件选择，到蛋白定量和保存，标准化操作是提高Western Blot重复性和实验成功率的重要基础。