非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种无酒精滥用的肝病综合征，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主要病变，是一种世界流行的慢性疾病。

 

NAFLD有多种疾病发展进程，初期为可逆转的肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎（NASH），如果不能得到有效治疗，后期将发展为不可逆的纤维化（Fibrosis），甚至导致肝硬化、肝细胞癌（HCC）或肝功能衰竭等终末期肝病。

（DOI:10.3389/fphys.2018.01256）

 

在过去20年里，NAFLD的发病率爆发式的增长，给人类带来巨大的经济负担和生命健康威胁。

 

目前的假说认为NASH是多种因素共同作用的后果，包括胰岛素抵抗、遗传、肥胖、代谢综合症（比如高血压、高血糖、腹部脂肪堆积，以及它们导致的心血管疾病与Ⅱ型糖尿病）和药物损伤有关。

 

（DOI:10.1016/j.plipres.2015.05.002）

 

由于NAFLD病理生理的复杂性，目前其确切发病机制尚不完全清楚，也缺乏有效的治疗方法。疾病动物模型是研究人类疾病发生发展机制、药物筛选及疗效评价必不可少的工具。因此，选择合理的NAFLD模型，将有助于加快药筛进程、验证新疗法和更快解决NASH生物学发病机制等方面的问题。

 

根据模型制作方法，可分为饮食诱导、化学物质诱导、基因编辑等几种模型。

（DOI:10.1016/j.cmet.2018.10.012）

 

一、饮食诱导模型

 

高脂肪（HF）、高葡萄糖、蔗糖（SUCR）、果糖（FRUC）、蛋氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食，胆碱缺乏L-氨基定义（CDAA）饮食，高胆固醇饮食（HC）等这些饮食可以单独提供或以一种或多种的组合提供，以诱发单纯性脂肪变性和脂肪性肝炎。

 

不同的饮食诱导模型具有不同的特点。饮食诱导模型的一个挑战可能是在开始研究之前需要较长的时间造模。

 

（DOI:10.1016/j.drudis.2017.06.007）

 

（1）高脂肪饮食（HF）

 

高脂饮食通常由30-60%的脂肪组成，与以饱和脂肪为基础的饮食相比，含有大量不饱和脂肪的饮食会导致更明显的肝脏脂质过氧化，以及更高的趋化因子和细胞因子表达。

 

该模型稳定性好，可重复性高，方法简便，可形成肥胖、高代谢综合征等表现的与人类NAFLD发病机制最相似的经典非酒精性脂肪肝病，适用于NAFLD的发病机制研究以及药物的筛选和干预研究。

 

高脂饮食模型也有一定的局限性，如建模所需时间较长(通常需要12-16w)，且形成的肝纤维化和炎症改变均较轻，而且随着动物种系和饮食配方的不同呈现出多样性。

 

（2）高果糖饮食（FRUC）

 

长期适量摄入果糖可导致肠道菌群过度生长和肠黏膜屏障通透性增加，门静脉内毒素浓度增加，激活Kupffer细胞而引起致敏的肝组织脂肪变性造成肝损伤。

 

该模型造模简便、快速，细胞脂肪改变明显，适用于NAFLD药物筛选的研究。然而，胰岛素抵抗和炎症反应轻，不适宜发病机制的研究。

 

（3）胆碱-蛋氨酸缺乏(MCD)饮食

 

蛋氨酸和胆碱在肝脏β氧化和极低密度脂蛋白的产生和分泌中发挥作用，它们不能从头合成，因此必须包含在饮食中。蛋氨酸和胆碱的缺乏引起线粒体β-氧化功能不正常和极低密度脂蛋白合成量减少，加重了炎症发生及促进了肝纤维化的早期发生。

 

该模型操作方法简单，重复性好，可在短时间内诱导小鼠出现大泡性脂肪变性、炎症、纤维化病变，病变程度高，与人类NASH表现相似，适用于脂肪肝治疗药物的筛选。

 

然而，造模饲料价格昂贵，且该模型与人类NASH的代谢特征有差异，动物不伴超重或肥胖，无胰岛素抵抗和低血清胰岛素、空腹血糖、瘦素和甘油三酯水平，在表型和机制上不能完全模拟与代谢综合征相关的非酒精性脂肪肝炎，病理学表现也有较大差异。

 

因此，通常db/db或ob/ob小鼠喂养MCD饮食可以更好地复制人类NASH病理过程。

 

二、化学物质诱导模型

 

化学物质诱导的肝损伤和肝纤维化很常见，已用于小鼠肝脏纤维化模型的构建，这类模型发展到肝硬化和肝癌的几率也很高。常用的诱导物有，四氯化碳（CCL4）、四环素、硫代乙酰胺（TAA）和链脲菌素（STZ）等。CCL4和TAA常用于成年鼠，STZ用于新生鼠。

 

（DOI:10.1016/j.drudis.2017.06.007）

 

 

（1）四氯化碳(CCl4)诱导

 

CCl₄是最早采用的试验性脂肪肝模型诱导剂，可单独施用或配合高脂饮食来诱发脂肪肝或肝纤维化。

 

四氯化碳（CCl4）具有肝毒性，进入机体后在肝内产生活化氧自由基，过氧化作用增强，加快肝脂肪变性进程，损伤肝细胞，造成肝细胞变性坏死，引起细胞外基质(ECM)过度沉积而成肝纤维化，其代谢产物还可以刺激肝脏Kupffer细胞，释放促炎性细胞因子，进一步加重肝脏的损伤。

 

这种方法造模时间较短（8周左右），形成率高。适用于肝纤维化的研究。但是发病机制、病程变化及组织学形态与人类脂肪肝存在较大差异，并且CCl4具有较强的毒性，易致动物死亡。

 

（2）四环素诱导

 

四环素属于抗生素类药物，具有肝毒性，可用于诱发动物脂肪肝。其主要通过干扰线粒体DNA复制或转录，抑制载脂蛋白合成并影响线粒体脂肪酸β-氧化，抑制肝脏极低密度脂蛋白的释放，脂质以脂滴形式聚于肝细胞内，继而造成肝细胞脂肪变性。

 

该模型造模时间短，费用低，药物毒性较CCl4弱，脂肪变性显著，适用于模拟某些环境因素所致的NAFLD研究，也具有CCl4类似的缺点。

 

（3）链脲菌素

 

链脲佐菌素诱导模型常见于诱导Ⅱ型糖尿病的实验性模型。小剂量链脲佐菌素结合高脂饮食，已被用于制备小鼠的NAFLD，可导致脂肪变性，炎症，纤维化甚至肝细胞癌。

 

该模型可以诱发氧化应激、炎症、纤维化和肝细胞凋亡，符合NAFLD的组织病理学。但与人类NAFLD的胰岛素抵抗不同的是，链脲佐菌素会破坏胰岛β细胞功能，而不会导致全身性的胰岛素抵抗，因此，这也限制该模型在临床前药物研究中的使用。

 

三、基因编辑模型

 

细胞脂肪的生成与清除受多种基因的调控，其突变、缺失、过度表达或修饰都可能影响脂肪的代谢，从而形成脂肪肝，对动物的基因进行人为干预，就可改造出NAFLD动物模型。

 

（DOI:10.1016/j.drudis.2017.06.007）

 

（1）ob/ob小鼠和db/db小鼠

 

db/db小鼠和db/db小鼠是NAFLD的良好模型，是国内外常用的NAFLD的动物模型。

 

ob/ob小鼠存在ob基因（瘦素编码基因）自发突变，使得瘦素合成障碍，由于瘦素产生的缺乏，普通饮食即可诱导出现许多和人类NAFLD相似的特征，如肥胖、高胰岛素血症、高脂血症、糖尿病等。

 

db/db小鼠则是由于db基因(瘦素受体编码基因)突变，导致瘦素受体功能受损，失去信号转导活性，引起瘦素抵抗，出现与ob/ob小鼠相似的特征。

 

但由于在人类中极少出现瘦素受体等基因突变，这两类模型在复制人类NAFLD方面不如饮食诱导的模型。并且这些基因缺陷的小鼠模型不能自发地由单纯性脂肪肝发展成脂肪性肝炎，只有联合胆碱-蛋氨酸缺乏饮食、高脂饮食或化学物质诱导进行“二次打击”，才可演变为显著的NASH。

 

（2）foz/foz小鼠

 

foz/foz小鼠具有突变的Alms1基因，可能在细胞内运输和食欲调节中起作用。foz/foz小鼠是病态肥胖的，在出现肝脂肪变性同时，可伴有胰岛素抵抗，脂联素水平显著降低，胆固醇水平明显增加。

 

（3）ApoE-/-小鼠

 

ApoE是脂蛋白受体的高亲和力配体，存在于除低密度脂蛋白（LDL）外的其他脂蛋白上。ApoE在肝脏对乳糜微粒和极低密度脂蛋白（VLDL）残余颗粒的摄取和肝脏VLDL的分泌起着重要的作用。

 

高脂高胆固醇饮食诱导ApoE-/-小鼠在出现肝脂肪变同时，可伴有特征性的炎细胞浸润改变，以及出现高脂血症、糖尿病、胰岛素抵抗以及动脉硬化等代谢综合征的组分，是一种理想的NASH模型。

 

（4）Ldlr-/-小鼠

 

低密度脂蛋白受体（Ldlr）基因家族，由参与特定配体受体介导内吞作用的细胞表面蛋白组成。Ldlr-/-小鼠小鼠血清胆固醇水平，是野生小鼠的2~4倍。结合高脂（HFD-fed）饲喂Ldlr-/-小鼠，可以诱导以肥胖、高胆固醇血症为特征的代谢综合征、高甘油三酯血症和胰岛素抵抗症状。

基因编辑和化学物质诱导的方法可以更快地造模，但是模型可能与疾病诱导机制无关。

四、复合模型

 

 

上面三种模型均不能完全模拟人类NAFLD的发病机制，许多学者把基因编辑模型与饮食或化学诱导相结合建立复合模型，使模型的表型和发病机制与人类NAFLD更接近，病理变化显著，从而最大程度地模拟人类的NAFLD。

不同方法制备的脂肪肝动物模型的表型和形成机制各异，按照研究的目标选择最适合的动物模型，尽量选择与人类疾病相似、方法简单、成功率高、和重复性好的实验模型。

 

构建NAFLD动物模型主要有大鼠、小鼠、沙鼠、家兔、小型猪等，但主要以大鼠造模最为常见。下面详细介绍高脂+四氯化碳诱导大鼠非酒精性脂肪肝模型的造模步骤及评价方法。

 

实验动物：SD或Wistar大鼠

 

大鼠接受4周高脂饮食，于第3周开始每周2次皮下注射40%四氯化碳豆油溶液构建非酒精性脂肪肝模型。于最后一次注射后第3天取大鼠肝脏进行观察。

 

 

模型评价

 

1）生理学指标：肝指数=肝脏重（g）/体重（g）×100%；

 

2）生化指标：肝脏总脂、血浆游离脂肪酸、血糖、血浆胰岛素、ALT、AST、TC、TG等的含量检测；

 

3）形态学方面：肝组织切片染色，观察是否有脂肪沉积、炎症、炎性细胞浸润、坏死、线粒体损伤、胶原染色观察等等。

 

对照组大鼠肝小叶结构完整，轮廓清晰可见，肝窦正常，肝索以中央静脉为中心呈放射状整齐排列，肝细胞胞质均匀，呈多边形，无变性；模型组肝实质结构受损严重，明显可见空泡性脂肪变性，门管区炎症细胞浸润，且有不同程度出血现象，伴有纤维化。