6.5.1.1单层培养细胞实验技术

        细胞克隆（集落）计数法1956年 Puck和Marcus首次应用细胞克隆计数法探讨了辐射剂量与人宫颈癌细胞株Hela-S3存活的关系，为离体细胞辐射敏感性和辐射修饰剂的研究提供了最基本的定量研究手段。至今该方法仍为离体细胞放射生物学广泛应用。克隆计数法具体方法详见7.1.2节。这里仅介绍克隆计数法在离体细胞辐射敏感性试验中应用的基本过程。

        首先取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单个细胞悬液。对于难分散的细胞可用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA（1：1）混合消化，制成单细胞悬液，用0.4%台盼蓝染色，计数活细胞数，并按梯度稀释法将细胞悬液稀释至所需密度，将细胞接种在适当的培养器皿中如直径35~60 mm的培养皿，然后在37℃、5%CO₂+95%空气及100%饱和湿度条件下培养。待细胞完全贴壁后，进行各种实验处理（乏氧处理、加药、放射线照射等），然后继续在CO₂孵箱内静置培养8~14d（培养时间依对照组出现肉眼可见克隆的时间而定），取出培养皿，弃去培养上清液，用甲醇固定，Giemsa染色，最后计数含50个细胞以上的克隆，并进行计算。

        接种率（plating effciency，PE） =（对照组克隆数/细胞接种数）x100% 

        存活分数（survivingfraction,SF）=实验组克隆数/（细胞接种数xPE）

6.5.1.1.2四唑盐比色法（MIT法）

        MIT法是一种定量检测活细胞的方法，最早用于检测淋巴细胞的增殖活性，以后广泛用于肿瘤细胞的化学敏感性检测，近年应用于肿瘤细胞辐射敏感性试验。试验基本过程包括：①制备单细胞悬液；②接种96孔培养板；③进行实验处理如加药、照射等；④MIT检测（具体方法见7.1.3MIT比色试验）；⑤统计处理数据，将测得的吸光值转换为细胞数，求存活分数。

        存活分数（SF）=实验组对数生长期细胞数/对照组对数生长期细胞数

        MIT法与克隆法比较具有以下几个优点：①适用性广。悬浮生长细胞、贴壁生长细胞、克隆形成细胞及多细胞球体均可应用；②实验周期短。一般1周左右即可出结果；③重复性好；④实验成本低。然而，要获得可靠的实验结果，必须充分了解受试细胞MIT还原产物吸光值的大小与细胞数量之间的线性关系范围，选择适当的接种细胞密度及细胞培养时间。否则，实验误差仍会偏大。