动物组织总蛋白提取

1. 准备裂解液。按RIPA裂解液:PMSF=100:1的比例现配裂解液，混匀后置于冰上备用。
2. 准备适量预冷生理盐水或PBS，并全程置冰。提前准备好研磨管和研磨珠并做好标记。以鼠脑组织为例，可使用3mm研磨珠4颗。
3. 准确称取组织样本，并剪碎成小块后加入研磨管。为去除血液干扰，可先用预冷PBS冲洗组织3～5次，再用滤纸吸去表面多余液体。
4. 向组织中加入预冷裂解液。常用方法如下：
   对于250mg组织，可加入1mL裂解液。
   也可按组织重量的5倍体积加入裂解液，再加入等体积生理盐水稀释。例如，30mg组织可加入150μL裂解液+150μL生理盐水。具体比例以试剂说明书推荐条件为准。
5. 将样品置于研磨仪中，在4℃条件下研磨，每次60秒，共3次，直至组织充分匀浆。
6. 准备并标记新的EP管，用移液器小心吸取组织匀浆液。
7. 将匀浆液置于冰上裂解30分钟。期间每10分钟轻轻震荡一次，每次30秒～1分钟，以促进充分裂解。
8. 裂解完成后，于4℃、12000rpm离心25分钟。
9. 小心吸取上清液，转移至新的已标记EP管中。所得上清可用于后续蛋白定量或分装后置于-80℃保存。

BCA蛋白定量

1. 配制BCA工作液。按试剂A:试剂B=50:1配制。根据总加样孔数计算所需总体积，每孔加入200μL。其中，B液体积为总量的1/51，A液体积为剩余部分，混匀备用。
2. 配制蛋白标准品。按每孔加入20μL BSA标准品的体系，进行梯度稀释，建立标准曲线。可在96孔板上设置标准品孔，并建议设置复孔以提高数据可靠性。
3. 处理待测样品。样品可先按10倍稀释，每孔加入20μL。例如，可按2μL样品+18μL PBS进行稀释，具体稀释倍数根据样品浓度适当调整。
4. 向各标准品孔和样品孔中加入200μL BCA工作液。
5. 将96孔板置于37℃孵育30分钟，注意避光。
6. 孵育结束后，使用酶标仪测定吸光度，并导出原始数据。
7. 根据标准品数据绘制标准曲线，建立线性回归方程，并记录R²值。
8. 根据线性方程计算样品蛋白浓度，并进一步换算实际浓度、总蛋白量、终浓度、每孔上样量及上样体积等参数。

蛋白上样准备（Protein Loading）

1. 取出并融化上样缓冲液（Loading Buffer），置于实验台备用。
2. 吸取已提取并定量完成的蛋白样品，记录样品体积。
3. 按上样缓冲液浓度计算加入体积。若使用5×Loading Buffer，则加入量按以下公式计算：
   上样缓冲液体积=蛋白样品体积÷4

4.将计算好的上样缓冲液加入蛋白样品中，轻轻吹打混匀。

5. 将样品置于加热模块或金属浴中，100℃加热10分钟，使蛋白充分变性。
6. 加热结束后，可进行短暂离心以收集管盖和管壁液滴，随后立即置冰快速冷却。
7. 样品可根据实验安排直接上样，或短期置于-20℃、长期置于-80℃保存。
8. 储存过程中应避免反复冻融，以免影响蛋白稳定性和后续检测结果。

注意事项

1. 采样和处理过程中，操作人员应佩戴手套、口罩和帽子，尽量避免角蛋白等外源污染进入样本。尤其应避免PEG等聚合物污染。
2. 样本采集、处理、分离和冻存全过程应尽量快速完成，减少蛋白降解风险。
3. 采样部位应具有代表性，并严格区分实验组与对照组。对于脑组织等异质性较高的样本，应尽量精确定位具体取材区域。
4. 各组样本在采样部位、处理时间和操作流程上应保持一致，以减少实验误差。
5. 样本处理过程应尽量保持低温。采样后如不能立即处理，应尽快放入液氮、干冰或-80℃环境保存。
6. 样本应按实验设计提前分装，避免反复冻融导致蛋白降解。
7. 建议使用质量可靠的离心管或冻存管，减少运输、冻存和操作过程中破裂或引入污染的风险。特殊样品可用洁净锡箔纸包裹后装入自封袋，并做好标识。