概述

细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

用品

与细胞传代和细胞计数法相同

步骤

（1）取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。经计数后，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内（常用10mL培养瓶，亦可用24孔培养板），每瓶细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。

（2）酌情每天或每隔1d取出3瓶细胞进行计数，计算均值。一般每隔24h取1瓶，连续观察1~2周或到细胞总数开始减少为止（一般需10d左右）。培养3～5d后需要给未计数的细胞换液。

（3）以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数坐标纸上。连接成曲线后即成该细胞的生长曲线（图4-3）。

细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20%～30%的误差，需结合其他指标进行分析。

现在很多实验室利用96孔培养板采用MTT法来进行生长曲线测定，较为简便。下面简要叙述MTT法的操作过程：一般取第二代或是第三代的细胞用来检测，当细胞在培养皿底融合约90%左右时，吸弃原培养液，PBS漂洗2～3次后，按照上述的细胞消化分离的方法，即用0.25%胰蛋白酶消化离心后重悬制备成单细胞悬液，计数，并调整细胞密度为1x10⁴/mL，根据细胞生长的边缘效应在96孔板中共设9列，每列设6个复孔和2个空白对照孔，复孔中每孔加入200µL单细胞悬液，空白对照孔（不加细胞）只加入培养基，共接种8块96孔板。然后置于37℃、5%CO₂，孵箱内培养，24h后随机取1块96孔板进行MTT呈色反应检测，实验步骤为：在实验孔和空白对照孔中各加入20µL（5mg/mL）的噻唑兰（MTT），置于37℃、5%CO₂，孵箱内静置培养4h后，小心吸出孔内的液体后，每孔内再加入150µL的二甲基亚砜（DM-SO），震荡10min后，在吸光度为490nm的酶标仪上检测各孔吸光度值，每24h检测1块96孔板，连续测量9d，以细胞吸光度值为纵轴，培养时间为横轴绘制细胞生长曲/伕默线（图4-4）。

结果分析

标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第1天细胞数有所减少，再经过几天的滞留期，然后进入对数生长期。达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。

在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。细胞倍增的时间区间即细胞对数生长期，细胞传代、实验等多应在此区间进行。细胞群体倍增时间的计算方法有两种：A.作图法：在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间，即倍增时间。B.公式法：按细胞倍增时间计算细胞群体倍增时间（doublingtime，DT）。

DT =tx [lg2/(lgNt -lgNo)]

公式中t代表培养时间，No代表首次计数获得的细胞数，Nt代表培养t时间后的细胞计数。一般情况下，首次计数在细胞接种24h后进行，而Nt是细胞在对数生长期终点时的细胞数。

操作提示

细胞生长曲线包括潜伏期、指数生长期及平台期，通常观察时间7～10d，因此，要根据每种细胞的生长速度控制好接种细胞密度。细胞接种数不能过多也不能太少，太少细胞滞留期太长；数量太多细胞将很快进入平台期，要求在短期内进行传代，曲线不能确切反映细胞生长情况。一般接种数量以7～10d能长满而不发生生长抑制为度。同种细胞的生长曲线先后测定要采用同一接种密度，这样才能做纵向比较；不同的细胞也要接种细胞数相同，才能进行比较。