1.方法原理

全血样本中的基因组DNA主要来源于有细胞核的白细胞。成熟红细胞不含细胞核，不能提供基因组DNA，反而会引入血红蛋白、细胞碎片、盐离子及内源性核酸酶等杂质，影响DNA提取质量和后续PCR、qPCR、测序等实验。

因此，全血样本DNA提取流程通常是：全血样本接收与编号→红细胞裂解→离心收集白细胞沉淀→白细胞裂解→蛋白酶K消化→去除蛋白质和杂质→DNA结合或沉淀→洗涤→洗脱或复溶→浓度、纯度和完整性检测→分装保存。

2.样本要求

全血样本建议使用抗凝管采集，常用EDTA抗凝管。采集后应尽快提取DNA；短期保存可置于4℃，长期保存建议分装后置于-20℃或-80℃。反复冻融样本会导致白细胞破裂、DNA降解和杂质释放增加。

若后续用于PCR或测序，应尽量避免使用肝素抗凝样本，因为肝素可能抑制聚合酶反应，影响后续扩增结果。

3.主要提取纯化方法

3.1离心柱法

该方法是全血DNA提取中最常用的方法。首先使用红细胞裂解液去除红细胞，离心收集白细胞沉淀；随后加入裂解液和蛋白酶K，使白细胞裂解并释放DNA；再加入结合液或乙醇，使DNA在特定盐浓度条件下吸附到硅胶膜离心柱上；经过洗涤去除蛋白质、盐离子、血红蛋白、乙醇和其他杂质；最后使用无核酸酶水或TE缓冲液洗脱DNA。

该方法操作简便、速度快、重复性较好，适合常规动物全血样本DNA提取。缺点是离心柱结合量有限，若样本量过大或白细胞数量过高，可能导致柱膜过载，影响DNA产量和纯度。

3.2磁珠法

这个方法同样需要先去除红细胞并富集白细胞，随后裂解白细胞释放DNA。DNA在特定盐离子和pH条件下与硅基磁珠表面结合，通过磁力架或自动化设备完成分离、洗涤和洗脱。

磁珠法适合批量样本、高通量检测和自动化平台，尤其适合动物实验中样本数量较多的情况。其优点是操作一致性较好、自动化程度高；缺点是试剂成本相对较高，对磁珠混匀、吸附时间和干燥程度要求较高。

3.3酚/氯仿抽提-醇沉淀法

该方法先通过红细胞裂解获得白细胞沉淀，再加入SDS裂解液和蛋白酶K裂解白细胞并消化蛋白质。之后使用酚/氯仿抽提去除蛋白质和脂类杂质，再加入乙醇或异丙醇沉淀DNA，最后用无核酸酶水或TE缓冲液复溶DNA。

该方法适合获得较高分子量DNA，成本较低，但步骤较多，耗时较长，且涉及酚、氯仿等有毒有机试剂，需要在通风橱中操作。操作不规范可能导致有机溶剂残留，抑制后续酶反应。

3.4盐析法

盐析法通过裂解白细胞释放DNA，并利用高盐条件使蛋白质等杂质沉淀，DNA保留在上清中，再通过乙醇或异丙醇沉淀DNA。该方法不使用酚/氯仿，安全性相对更高，适合部分常规全血DNA提取。

盐析法成本较低，适合样本量较大的情况，但纯度和稳定性受操作条件影响较大，若盐分去除不充分，可能导致OD260/OD230偏低，并影响后续PCR或测序。

4.注意事项

1）红细胞裂解要充分，但不能过度处理，避免白细胞破裂造成DNA损失。

2）白细胞沉淀应尽量去除残留红色上清，减少血红蛋白污染。

3）蛋白酶K消化应充分，否则会导致蛋白残留，表现为OD260/OD280偏低。

4）洗涤后应去除残留乙醇，乙醇残留会抑制PCR、酶切和建库反应。

5）洗脱时可根据后续实验选择无核酸酶水或TE缓冲液。若后续用于PCR、qPCR或测序，通常优先选择无核酸酶水；若用于长期保存，可选择TE缓冲液。

6）样本应分装保存，避免反复冻融导致DNA降解。

5.质检

提取完成后应检测DNA浓度、纯度和完整性。浓度可使用Nanodrop或Qubit检测，其中Qubit对DNA定量更准确，尤其适合低浓度样本和测序前定量。

DNA完整性可通过1%–2%琼脂糖凝胶电泳检测。完整的基因组DNA通常表现为靠近上样孔的明亮大分子条带，无明显拖尾或弥散；若出现明显弥散或拖尾，说明DNA存在降解或机械剪切。 

6.样本保存

DNA样本建议分装保存。短期可置于4℃，保存时间不宜过长；长期保存建议置于-20℃或-80℃。对于高价值样本，应避免反复冻融，并在样本管上标注样本编号、动物编号、样本类型、DNA浓度、体积、提取日期和操作者。