(一)模型概述

        特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies，IIM)是一组以骨骼肌受累为主要表现的异质性疾病，主要包括多发性肌炎(polymyositis，PM)、皮肌炎(dermatomyositis，DM)及包涵体肌炎(inclusionbody myositis，IBM)，其中以 PM 和 DM 比较多见。IIM 主要累及四肢近端及颈、咽部肌群，属于炎症性横纹肌病。IIM 的确切病因并不清楚，尽管近年来IM 的研究逐渐增多，在其发病机制、病理改变、治疗方法及疗效等方面均取得一定进展，但目前仍有许多问题尚待解决。制作实验性自身免疫性肌炎模型(experimental autoimmune myositis，EAM)可以在肌肉活检标本不足的情况下深入研究其发病机制，为寻找有效的治疗方法提供更多理论依据。

        自Dawkins于1965年应用免骨骼肌匀浆免疫豚鼠的方法建立与人类PM相似的大鼠模型至今，异科动物骨骼肌成分作为免疫诱导物建立自身免疫性炎性肌病动物模型的方法已经成为PM以及IIM 研究领域中经典的建模方法。本文主要介绍应用免骨骼肌匀浆作为免疫物诱导Lewis大鼠建立IIM大鼠模型这一传统建模方法。

(二)造模方法

        1.肌匀浆制备 取新鲜兔(通常为新西兰大白兔)骨骼肌组织，冰台上剔除其神经、血管、筋膜、脂肪组织，纯骨骼肌肉称重，按 20%的重量体积比加入适量体积经高压灭菌的PBS缓冲液，冰水浴中用刀式匀浆机1700r/min匀浆3次，每次 30s，间隔30s，4层纱布覆盖入4℃冰箱过滤。次日收集滤液再用磨式匀浆机3000r/min 匀浆3次，每次 30s，间隔 30s。过滤后按 100：1的体积加入去垢剂 Triton X-100 磁力搅拌器搅拌均匀，2500转4℃离心10分钟，取上清液予考马斯亮蓝蛋白定量法进行蛋白浓度定量(20mg/ml)，分装后置于-20℃冰箱内储存。使用时按所需浓度稀释，与弗氏完全佐剂(Freund's complete adiuvant，FAC)按1：1的体积比充分乳化后用于免疫动物。

        2.免疫方法 免疫大鼠时用制备好的免骨骼肌匀浆与FAC充分乳化后皮下多点注射，注射部位多为双后肢及臀、背皮下，注射时应注意避开脊柱部位，必要时脚掌亦可进行注射。通常每周1次，连续免疫5周，前两周均同时腹腔注射百目咳毒素每只2微克/次。操作者可预先进行多次预实验，根据其结果确定最佳肌匀浆蛋白浓度及免疫周数。笔者经验是每次注射肌匀浆浓度以10mg为佳，通常连续免疫4~5周即可。同时应设立对照组，用生理盐水替换肌匀浆以相同方法操作。

        3.大鼠肌炎检测方法

        (1)免疫后临床表现及其评分：大鼠免疫1周后根据动物体重、姿势、呼吸及活动等情况，参照 Lennon-LA等的方法进行评分：1分，无明显的肌无力表现：2分，无力咬啮或喊叫：3分，休息时降起体位，头下垂，前肢屈曲，行走震颤;4分，严重肌无力，不喊叫，体重减轻，甚至肌肉萎缩，呼吸困难，濒于死亡。临床表现居中者可增加0.5分。

        (2)血清肌酶测定：大鼠免疫1周后可行内眦动脉、心脏或腹主动脉采血2ml，3000r/min离心10分钟后取上清液冻存于-20℃中，应用自动生化仪检测血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶，谷草转氨酶等肌炎相关酶类的数值变化。

        (3)肌电图检测：大鼠免疫1周后以3.5%~4%水合氣醛腹腔注射麻酔(1ml/kg)后用肌电图仪检查双后肢肌电图，观察肌电图时限、波幅、多相波的变化。

        (4)肌肉MRI检查：大鼠免疫1周后选择双下肢和骨盆行轴面扫描，扫描序列为自旋回波(SE序列)T1W和快速回波序列(FSE序列)T2WI。并行STIR序列增强病灶与周围组织对比度。观察肌肉组织在T1WI、T2WI及STIR上的变化。

        (5)骨骼肌病理检查：大鼠免疫1周后以3.5%~4%水合氣醛腹腔注射麻醉[1毫升/(千克·次)]后取双侧股四头肌，置于 10%甲醛固定 24~48 小时，经脱水、透明后石蜡包埋，制成 4~6μm厚的连续切片，H-E染色后光镜观察肌肉病理改变，并根据Kohyama 等分级标准对骨骼肌病变程度进行分级评定：0级，正常肌纤维;1级，1~5个肌纤维受累;2级，5~30个肌纤维受累;3级，病变累及整个肌束;4级，弥散性病变。肌肉病变居中者可增加0.5分。

(三)模型特点和应用

        1.免疫后临床表现 大鼠免疫2周后逐渐出现食量减少、体重减轻、毛色暗淡、杂乱，4周左右出现活动减少、肌肉萎缩，前肢屈曲、后肢无力，直立进食困难。对照组大鼠免疫 2~3周后出现短暂体重减轻，1周左右即恢复增长，毛色基本正常，活动、进食不受影响。模型组和对照组大鼠免疫注射后背部皮肤均出现不同程度的硬结和破溃，模型组大鼠硬结直径较大，0.5~1.5cm，破溃局部渗出较多，愈合较慢，4周左右结痂，局部硬结较难吸收。对照组硬结直径较小，0.3~0.6cm，破溃面积较小，1周左右即结痂愈合，局部硬结吸收良好。

        2.血清肌酶动态变化 血清肌酶谱升高多在病程的活动期，血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶、谷草转氨酶广泛存在于肌细胞质中，当肌纤维炎症病变时，肌细胞被破坏或肌细胞膜通透性增高，上述肌酶释放到血清中，导致血中肌酶谱增高，可较全面地反映病变的程度。其中肌酸激酶敏感性最强，升高最早，最高达正常值 20余倍，并且与病变严重程度具有一定相关性。但笔者经验认为，虽然肌酶谱升高趋势符合模型病变的进展规律，但大鼠的血清肌酸激酶水平变异程度较大，并不推荐作为单独或主要指标评定模型成功与否。

        3.肌电图检测 肌电图是一种常用的肌肉病变检查方法。IIM 患者的主要肌电图表现为时限缩短，波幅降低，多相波增多，此类表现也可见于免疫4周后大鼠，提示模型组大鼠有肌源性损害。

        4.肌肉MRI检查 因MRI对软组织的分辨率高，灵敏度高，近年来MRI被应用于IIM 的诊断。在PM活动期，其受累的肌群可能出现T2WI呈高信号，T1WI呈等低信号或T2WI与T1WI均呈高信号，提示炎症水肿样病变或脂肪替代样病变。模型大鼠病变多尚处于较早期，MRI在T2WI及STIR序列上均呈高信号改变，呈斑片状，说明炎症水肿改变。

        5.骨骼肌病理检查 肌肉病理是诊断ⅡM 的金标准，也是评 EAM 价模型成功与否最重要的方法。大鼠免疫2周后出现不同程度的肌肉病理改变，表现为间质水肿，血管内皮肿胀，管壁增厚，肌纤维核增多，单核细胞浸润不明显。免疫4周后在间质病变同时可见到肌纤维多发性炎症改变，表现为肌纤维变性坏死、横纹消失、核内移，肌纤维直径大小不一、染色不均，单核细胞浸润包绕非坏死肌纤维及间质血管周围，部分可见肥大细胞增生和少量嗜酸粒细胞，再生肌纤维少见，以上表现均与人类多发性肌炎骨骼肌病变相似。对照组仅少数可见细胞核增多，无明显间质改变和单核细胞浸润表现。

        6.小结 通过异种动物骨骼肌匀浆诱导大鼠建立IIM 模型，其骨骼肌病理改变与人类PM 相似度较高，是一种经典而且成熟的建模方法。