一、概述

活性氧（Reactive Oxygen Species，简称ROS）是细胞代谢过程中产生的含氧活性分子，包括超氧阴离子（O2•-）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧和羟基自由基（•OH）等。ROS在生物体内既扮演着信号分子的角色，也可能导致氧化应激和细胞损伤。因此，检测ROS的水平对于研究氧化应激、细胞凋亡、衰老、癌症等多种生物学过程至关重要。

DCFH-DA探针检测活性氧（ROS）是一种常用的实验方法。DCFH-DA探针本身没有荧光，能够自由穿过细胞膜。在细胞内，它被胞内酯酶水解生成DCFH，随后DCFH被细胞内的活性氧氧化成具有荧光的DCF（2',7'-二氯荧光素）。DCF的荧光强度与细胞内ROS水平成正比，可以通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光分光光度计等设备进行检测。

DHE探针（Dihydroethidium）是一种荧光探针，用于检测细胞中的超氧阴离子（O2•-）。它是一种氧化敏感的染料，可以渗透到细胞中，在存在超氧阴离子的情况下，被氧化生成红色的荧光产物ethidium，从而可以用于活细胞或组织中活性氧种（ROS）的检测。

二、实验材料

PBS溶液、DCFH-DA/DHE探针、细胞培养相关耗材

三、实验方法

DCFH-DA探针检测活性氧：

1、细胞准备：将细胞培养至适当的密度，如50%-70%的汇合度。

2、药物诱导（如果需要）：去除细胞培养液，加入适量的药物于37°C细胞培养箱内孵育，诱导ROS的产生。

3、探针装载：探针DCFH-DA通常按照1:1000用无血清培养液稀释，使其终浓度为10 μM。去除诱导用药物后，加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。

4、孵育：37°C避光孵育30min。

5、细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞1~2次，去除未进入细胞内的DCFH-DA。

6、荧光检测：使用488 nm激发波长，525 nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。

DHE探针检测活性氧：

1、准备DHE溶液：通常，DHE以粉末形式提供，需要在使用前溶解。将DHE溶解在适当的溶剂中，如无菌的PBS（磷酸盐缓冲液）或DMSO（二甲基亚砜）中，制备成工作浓度的溶液。常见的工作浓度为2-10uM。

2、细胞处理：对于贴壁细胞，首先去除细胞培养基，用PBS清洗细胞以去除培养基中可能影响实验结果的物质。对于悬浮细胞，可以通过离心来收集细胞，并用PBS重悬。

3、探针装载：将DHE工作溶液添加到细胞中，使细胞在37°C的培养箱中与DHE共孵育。孵育时间通常为30min至1h，具体时间可能需要根据实验条件进行优化。

4、洗涤细胞：孵育后，用PBS清洗细胞，去除未反应的DHE，以减少背景信号。

5、荧光检测：使用荧光显微镜检测细胞。ethidium的激发光波长约为530-560nm，发射光波长约为590-620nm。

6、数据分析：通过测量荧光强度来定量超氧阴离子的产生。可以拍摄荧光图像进行定性分析，或者通过荧光强度的定量分析来评估ROS的产生。

注意事项：由于DCFH-DA可以被细胞内的酯酶激活，因此在加载DCFH-DA之前，通常需要去除血清，因为血清中含有酯酶。如果研究的重点是超氧阴离子，DHE探针可能是更好的选择，因为它对超氧阴离子具有较高的特异性。如果需要检测细胞内的总体ROS水平，或者研究涉及多种类型的ROS，DCFH-DA可能更为合适，因为它能够检测多种ROS。