概述

       脐血中有丰富的造血干/祖细胞，在外源特异性生长因子刺激下，可以增殖分化。

用品

       (1)脐血来自新生儿脐静脉穿刺所得。

       (2)培养基：IMDM培养基，含有L-谷氨酰胺4.00mmol、Hepes缓冲液、25 mmol/L、20% FBS； Metho Cult™ H4330培养基，主要成分包括0.9%甲基纤维素、30%胎牛血清(FBS)、1%牛血清白蛋白(BSA)、10^-4mo/LB-基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、3 kU/L的促红细胞生成素(EPO)；Methocult^TM CF+ H4535培养基，主要成分有0.9%甲基纤维素、30% FBS、1% BSA、10^-4 mol/L β-巯基乙醇、2mmolL L-谷氨酰胺、50μg/L重组人干细胞因子(rhSCF)、20μg/L重组人粒细胞单核细胞因子(rh-GM-CSF)、20μg/L重组人白细胞介素3(rhIL-3)、20μg/L重组人白细胞介素6(rhIL-6)、20μg/L重组人粒细胞因子(rhG-CSF)

       (3)6%羟乙基淀粉氯化钠注射液。

       (4)离心机、吸管、培养瓶或板。

步骤

       (1)无菌条件下从新生儿脐带中获得脐血。

       (2)有核细胞分离：将脐血混匀后转移到250mL滴瓶内，加入1/4量的6%羟乙基淀粉氯化钠注射液，充分混匀后悬挂于超净台内，放置45min。

       (3)吸取上层富含有核细胞悬液3 mL，于4℃、1000r/min离心8 min，去上清液后重新用5mL IMDM培养基悬浮细胞，1000r/min离心洗涤2次，并用含20% FBS的IMDM培养液调整细胞密度为1x10⁹/L供细胞集落培养用。

       (4)半固体集落培养：红细胞系集落形成单位(CFU-E)，的培养用Metho Cult^tm H4330培养基，0.9m培养基加入0.1mL的细胞悬液，充分混匀后转移至35mm的6孔培养板，于37℃、5%CO₂培养箱培养，每个标本重复3孔，适时观察。于第7天计数CFU-E。粒细胞单细胞系集落形成单位(CFU-GM)的培养培养基为Methocuh™ CF + H4535，1 mL培养基加入0.1mL细胞悬液，充分混匀后转移至35mm的6孔培养板，于37℃ 5%CO₂培养箱培养，每个标本重复3孔适时观察，14d计数CFU-GM集落数。

操作提示

       半固体的培养基，甲基纤维素要优于琼脂，细胞都能沉淀下去接触培养皿的底壁，有利于集落形成，以及后续的观察。

结果及鉴定

       红系集落培养第2天就可以观察到细胞分裂，第3天时可形成较小的细胞簇，第4~6天有50个以上细胞组成的致密型集落，显微镜下可以看到呈淡红色已经血红蛋白化的红系集落，以后集落体积增大。第8天时肉眼可见红色的红系集落第9~11天达高峰，以后只是集落的体积增大，集落数并没有增多。脐血第7天的CFU-E(>8个细胞)平均为(104 ± 48)/10⁵有核细胞，CFU-CM集落培养在第5天开始有集落形成，以后逐渐增多，第8~11天达高峰，此后集落不断增大，总的集落数并不增加。CFU-GM平均为(119 ± 65)/10⁵有核细胞。经联苯胺染色的红系细胞胞质呈橘红色，胞核呈紫红色；只培养2d的粒系细胞还未形成集落，胞质不呈橘红色，核形式多样。