概述

        淋巴细胞是血液中白细胞的主要组成成分，是人和动物机体完成细胞免疫和体液免疫的重要基础。淋巴细胞具有寿命长，激活后可分裂增殖的特性，因此很适合于离体培养。淋巴细胞来源广泛，既可从外周血或淋巴液中获取，也可从外周淋巴器官中获取，下面以胸导管淋巴液和外周淋巴结为例叙述淋巴细胞的分离和培养方法。

淋巴液中淋巴细胞的培养

用品

        (1)成年犬或羊胸导管穿刺所得淋巴液。

        (2)培养基：RPMI 1640，也可用MEM或DMEM，添加10% FBS，3.5 g/L葡萄糖、584 mg/L谷氨酰胺、15 mmol/L HEPES、100000 U/L青霉素和100 mg/L链霉素。

        (3)手术器械手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳、22号留置针和塑料导管。

        (4)离心机、吸管、培养瓶或板。

步骤

        (1)前肢静脉内注射戊巴比妥钠(25mg/kg)，麻醉动物。固定动物四肢剃去颈部皮毛。气管插管后连接呼吸机，呼吸频率控制在15~18/min。

        (2)在气管稍左侧切开皮肤，经气管与左颈内静脉之间入路。以静脉角为标志，寻找胸导管。

        (3)将留置针插入胸导管，拔出针接塑料管，引流淋巴液。

        (4)用盛有少量培养液的离心管收集淋巴液，然后离心(1000r/min，10min)2 次。

        (5)用培养液混悬沉淀细胞后，调整细胞密度，进行培养。

结果及鉴定

        淋巴液中可获得大量的淋巴细胞。经培养获得的细胞中99%以上是淋巴细胞。淋巴细胞的鉴定可用Ciemsa染色法和非特异性脂酶染色法鉴定。犬淋巴细胞中的小淋巴细胞为90%~95%，直径6~8μm。羊的中等大小淋巴细胞为70%~80%，直径9~12μm。细胞呈球形，核圆，胞质很少。

操作提示

        (1)为了防止淋巴液中的蛋白质凝结，在淋巴液中加人少量肝素。

        (2)在收集淋巴液过程中，将离心管放入冰中，以保存细胞活性。

淋巴结中淋巴细胞的培养

用品

        (1)成年犬或免的淋巴结，也可用手术切除的淋巴结。

        (2)培养基：常用RPMI 1640，也可用MEM或DMEM，添加10% FBS、3.5 g/L葡萄糖、584 mg/L谷氨酰胺、15 mmol/L HEPES、100000U/L青霉素和100 mg/L链霉素。

        (3)手术器械手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳、眼科剪和眼科镊

        (4)清洗液HBSS和不含Ca²⁺和Mg²⁺的 HBSS.

        (5)离心机、吸管、培养瓶或板。

步骤

        在犬经前肢静脉内注射戊巴比妥钠(25mg/kg)，在免腹膜腔内注射苯巴比妥钠(40mg/kg)，进行麻醉动物。取咽淋巴结或肠系膜淋巴结，放入预冷的HBSS 中。

        在肉眼或立体显微镜下，剥除淋巴结周围的疏松结缔组织，并剪去淋巴结被膜。

        将淋巴结移人盛有不含Ca²⁺和Mg²⁺的HBSS的培养皿内，先将淋巴结剪成薄片状，再剪成约1mm³小块。在室温下用恒温水浴振荡器轻轻摇晃 20min。

        用吸管反复吹打组织块，然后用100目不锈钢筛网滤出组织块。收集滤液，离心(1000 r/min，10 min)2次。

        用培养液混悬沉淀细胞，培养30min。吸出含有未贴壁的淋巴细胞的培养液，离心(1000r/min，10 min)

        用培养液混悬沉淀细胞;调整细胞密度，接种培养。

结果鉴定

        从淋巴结中取得的细胞中95%以上是淋巴细胞。淋巴细胞的鉴定可用Ciemsa染色法和非特异性脂酶染色法鉴定。淋巴细胞大小较均匀，主要是小淋巴细胞。细胞呈球形，核圆，胞质很少。

操作提示

        (1)由于兔的淋巴结较小，可用多个淋巴结取淋巴细胞。

        (2)一般不采用酶消化法，以免取得的细胞中含有较多的成纤维细胞。