01 MTT的检测原理

 

        MTT为黄色或橙黄色粉末状化学试剂，中文名噻唑蓝，其主要作用为检测细胞存活和生长。因此，其用途主要包括两方面：

        1.检测药物或其他干预方式对体外培养的细胞的细胞毒性测定。

        2.细胞增殖及活性测定。

        MTT的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶溶解所致的吸光度值与细胞数量成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞数量越多或活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。经验心得，MTT实验最终吸光度应当落于0.8~1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。

        因为MTT最终的量化形式为甲瓒结晶溶解测量吸光度，培养基的本底颜色将会对结果产生极大干扰，故最终测量前需要抽去培养液上清。因此，本实验主要适用于贴壁细胞，对于半贴壁或悬浮细胞相关实验，可考虑使用CCK8法。

 

02 MTT实验试剂

 

        MTT工作浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放-20℃避光保存即可。

1.MTT溶液：

        购买商品化MTT粉末，使用PBS或按照说明书要求，通常配置为5mg/ml终浓度的应用液。市售MTT粉末，一般包装为100mg、250mg或1g，个人建议对于价格昂贵的小包装药品，应当一次性配置成高浓度贮备液，避免多次使用天平称量分装。以100mg包装的粉末为例，100mg粉末应当溶解于20ml PBS中。

■ 具体步骤

1. 将MTT粉末通过低速离心处理，使其集中在包装瓶底部。
2. 使用移液枪吸取500~1000μl PBS溶液，加入含MTT粉末的小瓶中。反复吹打若干次，确保粉末与液体充分混合。
3. 将混合液转移至新的50ml离心管中。
4. 将枪头A（吸取MTT粉末的枪头）不丢弃，因为它上面沾有未溶解的MTT粉末。
5. 使用干净的枪头B，吸取500~1000μl PBS溶液，再加入MTT瓶中。注意避免枪头B粘上MTT粉末或液体。
6. 使用枪头A反复吹打MTT瓶中的液体，再将液体转移至50ml离心管。此过程重复数次，直到MTT瓶中不再残留药品。
7. 向50ml离心管中补充PBS，直到终体积达到20ml。
8. 使用枪头A反复吹打MTT悬液，确保MTT粉末完全溶解。
9. 将溶解后的MTT溶液转移至超净台，使用0.22μm孔径的水相滤器进行过滤，并分装。
10. 分装后的MTT溶液避光储存于-20℃。使用时，从-20℃取出解冻，解冻后可暂时避光存放在4℃，推荐使用时间不超过一周。MTT的使用需要严格遵循无菌操作规范。
11. 配制并过滤后的MTT溶液应为淡黄色清亮液体。如果发现液体变色（常为灰绿色）或在MTT药品的离心管口散布蓝色斑点（药品污染），应丢弃。

        注意：MTT具有强致癌性，使用时应采取适当的防护措施。生物实验过程中涉及的化学试剂通常毒性较强，操作人员应提高警惕，严格注意防护。

2.DMSO：

        DMSO，中文名为二甲基亚砜，是一种含硫有机化合物，常温下为无色透明液体，4℃即可冻结。DMSO被誉为“万能溶剂，具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物”。

 

03 MTT实验步骤

 

■ 试剂材料准备与实验仪器

        1）对数生长期细胞；

        2）受试因素（药物）；

        3）MTT：以PBS配制成5mg/ml，抽滤除菌，保存在4˚C；

        4）DMSO（二甲基亚砜）；

        5）96孔板；

        6）酶联免疫检测仪；

        7）细胞培养箱。

■ 其他准备物品

        各个课题组的具体情况或许有所不同，但养成实验前一天检查实验用品、耗材的习惯强烈建议养成。本次实验，应当提前准备MTT应用液、常规细胞培养全套、实验干预相关药品、无菌离心管、无菌枪头、96孔板等，确认所需耗材与药品足量。

■ 实验步骤

        1）铺板，使用96孔板，每孔细胞密度控制在4000-5000个，体积100μl每孔。

        2）5% CO₂，37℃孵育，正常4到6小时贴壁后即可,加入浓度梯度的药物。

        3）5% CO₂，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

        4）每孔加入20µlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

        5）终止孵育，小心去除上清，不要碰到孔板底部。

        6）每孔加入150µl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

        灰色为边缘孔，加入无菌PBS；绿色为空白组，不加细胞，只加入培养基和MTT。

        黄色为对照组，加入细胞，不加药；蓝色为实验组，加入细胞和药物。

■ 注意事项

        MTT实验的主要缺点在于如果操作和数据处理方法不当，结果可信度和可重复性很低，以拟合化合物IC50为例介绍操作中注意事项：

1）严格控制铺板密度和给药浓度（对结果影响最大）

        96孔板孔径很小，如果细胞密度过大，药物对肿瘤的抑制作用作用越小。同时，收样前，对照组孔内如果已经长满细胞，就不能模拟出48小时后细胞的真实数量，对结果也有影响。

        根据经验，建议铺板时每孔细胞个数在4000左右，给药时细胞密度控制在30%左右。孔底的细胞一定要均匀分布。

2）注意边缘效应

        细胞培养过程中，边孔水分蒸发很快，因此边孔内药物浓度会浓缩，细胞状况会更复杂。因此铺板只用中间60孔，边缘36孔加入无菌PBS。

3）给药浓度

        为拟合IC50，通常设置10个给药浓度，每种浓度5个复孔。收样时，最高浓度孔内细胞一定要抑制率能够达到90以上，并且同时有2个及以上点抑制率都能达到90%以上。

4）避光操作

        MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。

5）培养液

        贴壁细胞加MTT前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入 0.5%MTT，量为20μl/孔。

 

04 MTT数据处理

 

        将各孔OD值减去本底OD值（培养基+MTT+DMSO，不含细胞）或者对照组OD值，各个复孔取平均值±SD值即为最终结果。

        改良寇式法：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

        Xm：lg 最大剂量

        I：lg(最大剂量/相临剂量)

        P：阳性反应率之和

        Pm：最大阳性反应率

        Pn：最小阳性反应率

        举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下：

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

        抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值，如对于100μg/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：

代入计算公式：

Pm=0.869

Pn=0.135

P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142

Xm=lg100=2

lgI=lg100/50=0.301

lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655

IC50=45.186

该药物的IC50值为45.186μg/ml

 

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