在ES细胞的培养过程中，培养基如DMEM 只能满足细胞最基本的营养需要要使ES细胞既能无限增殖又不呈现分化趋势，则必须在基础培养基中添加一些成分。常见的有血清、2-巯基乙醇、丙酮酸钠以及氨基酸和细胞因子等，在这些添加成分中对ES细胞生长及抑制分化影响较大的为血清和细胞因子。

一、血清

        血清质量的好坏最直接影响到ES细胞的培养，使用优质血清ES细胞的克降率能达20%以上。值得注意的是在ES细胞分离克隆过程中并非血清浓度越高效果越好，实验中发现培养液中添加15%NBS时胚胎干细胞最容易分离，也最容易克隆传代。血清中可能含有某些未知的对细胞有害的成分，当血清浓度过高时血清对细胞的有害作用较强，或者血清浓度过高对所培养的细胞而言营养过剩从而引起的负反馈效果，这些问题值得更进一步研究。

二、 细胞因子

        在ES细胞的分离克隆过程中，人们常在基础培养液中添加许多细胞因子，一方面抑制ES细胞的分化(分化抑制因子)；另一方面刺激细胞的分裂增殖(生长因子)，以得到更多纯化的ES细胞。分化抑制因子包括 LIF、腺病毒 E1A 样激动剂A等。生长因子包括bFGF、EGF、SCF、IGF-1、Forskolin等。

2.1 分化抑制因子

        （1）白血病抑制因子(leukemia in-hibitory factor，LIF)：LIF 是目前研究最多应用最广泛的一种ES细胞分化抑制因子该因子是1969年被发现的一类能诱导M白血病细胞系分化为正常细胞的因子。根据分泌LF的细胞不同，开始时人们分别把其称为分化因子(DF)、肝细胞生长因子3(HGF3)、分化抑制因子(DIF)等比较了其蛋白质相应氨基酸序列和DNA中相应的碱基序列后，才知它们是同一种物质。在ES细胞分离与克隆研究开始时，人们常用与小鼠成纤维细胞饲养层或成系的小鼠成纤维细胞饲养层(STO)共培养，抑制ES细胞的分化而使其分裂增殖后来研究得知该饲养层的这种作用主要是因为它分泌细胞分化抑制因子，这种细胞因子类似 LIF。

        现研究表明，活化的T细胞、单核细胞、神经胶质细胞、肝成纤维细胞、ES细胞等均能表达LIF。根据LF前体蛋白N端信号肽起始若干个信号残基的不同，可将其分为分泌型(D型)和基质型(M型)两种，D型可分泌到细胞外液中，是可溶的，M型则锚定在细胞外基质上。饲养层细胞的细胞外基质可抑制 ES细胞分化就是由于其胞外基质存在大量锚定的LIF。ES细胞中微量表达的LF也主要为M型，M型LF的表达在ES细胞分化前后都较恒定，而D型LF则在ES细胞体外分化时表达量才显著提高。

        LIF最显著的生物学功能是体外抑制ES细胞分化，维持ES细胞的增殖和多能性。有实验表明，LF在0.1ng/mL浓度时，即可完全抑制 ES细胞分化。

        (2)腺病毒E1A样激动剂A：Hirolu-mi Suemori等发现腺病毒E1A样激动剂A存在于EC细胞附植前胚胎细胞和ES细胞中，而不存在于附植后胚胎细胞中，这提示该物质也可能作为ES细胞体外分化的抑制剂。

2.2 生长因子

        (1)碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor, bFGF)：bFGF是一种阳离子多肽，最初是从牛脑垂体和脑组织中分离得到的，因其有刺激3T3成纤维细胞分裂增殖的作用而得名。bFCF广泛分布于卵巢、睾丸、脑垂体、丘脑下部、黄体和胎盘等处。体外实验表明11 ng/mL浓度的bFCF可明显刺激成纤维细胞、卵巢颗粒细胞等的增殖。糖皮质激素和肝素都可增强bFCF的致丝裂作用。

        (2)表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)，又名尿抑胃素(urogastro-ne)：是一个小分子多肽，主要存在于动物尿液、乳汁、汗腺中，ECF具有很强促分裂作用。

        (3)干细胞因子(stem cell factor,SCF)，又称肥大细胞生长因子(mastcelgrowth factor，MCF)：最早从大鼠肝细胞系中分离出SCF，SCF以可溶性和膜结合两种形式存在，主要由肝细胞产生。人和小鼠的SCF约有80%同源性，多种干细胞集落形成细胞和肥大细胞等都有 SCF 受体。关于SCF对ES细胞的作用，目前认为可能有：SCF对干细胞有显著致分裂作用，能诱导干细胞进入细胞周期，提高转基因效率;SCF是干细胞生长的唯一调控因子;SCF能控制胚胎发生过程中发育不同阶段的蛋白。SCF被认为能通过抑制细胞凋亡而促进原始生殖细胞的生长。

        (4)胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)：最早从大鼠体内发现有一种促进软骨硫酸化的因子存在，因其在离体条件下具有胰岛素样作用故称为胰岛素样生长因子。此外，还发现其有介导生长激素促生长的作用，所以，又称之为生长调节素(生长介素somatomedin，SM)。IGF-1和胰岛素在结构和功能上很相近，在ES细胞培养中二者可互换。IGF-1可促进胚胎细胞DNA和蛋白质的合成，增加胚胎细胞数，调节囊胚腔的出现和胚胎从透明带孵出。IGF-1或胰岛素加入培养液中可促进受精卵卵裂，增加卵裂胚的紧实度和囊胚形成率促进饲养层与内细胞团细胞的蛋白质合成，从而促进饲养层和内细胞团细胞的分裂增殖。外源性促生长因子的添加与否对附植前胚胎的生长并不是至关重要的，只是生长因子可能对胚胎保持最佳发育速度有一定作用。在培养液中添加10~20 ng/mL IGF-1在ES细胞分离克隆时可取得良好的效果。

        (5)Forskolin：它是一种双萜类物质，它可以快速而可逆地激活腺苷酸环化酶的催化亚单位。Forskolin在抑制卵母细胞成熟的同时还可以通过cAMP途径诱导小鼠卵丘细胞释放促使卵母细胞成熟的物质。

2.3 其他细胞因子

        除以上研究较多的生长调节因子外还有肿瘤坏死因子(TNF)、催乳素(prolactin)、白介素-3(I-3)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(CM-CSF)等。研究证实TNF能刺激ES细胞的分化;在培养液中添加1μg/mL或5μg/mL的催乳素，对部分ES细胞系的建立具有促进作用;IL-3也能促进多能干细胞的增殖和分化;GM-CSF具促进多能干细胞增殖的作用。随着对各种细胞因子认识的日益增多，必将会为哺乳动物ES细胞分离克隆创造一个更好的条件。目前除常用的几种细胞因子，如LF、bFGF、EGF、IGF-1等外，还可以尝试应用腺病毒E1A样激动剂A、IL-3、GM-CSF、催乳素等。