一、获取早期胚胎

        不同动物获取早期胚胎的时间不同主要考虑以下方面因素。

        (1)取胚胎在条件允许的情况下，细胞尽可能地多。

        (2)在体外易于培养增殖并能保持多能性，小鼠一般取2.5~3.5d桑葚胚或囊胚;猪取9~10d囊胚;绵羊取7~8d囊胚或孵化胚;牛取6~7d桑甚胚;水貂取6~7d桑葚胚或囊胚;人取7~8d囊胚。除从动物体内直接获取新鲜胚胎外体外受精所得胚胎与核移植所得的重构胚亦可作为 ES细胞分离克隆的原材料。

二、早期胚胎培养及早期胚胎内细胞团的获取

        目前早期胚胎培养多采用DMEM培养基，此培养基是MEM(minimum essen-tial medium)培养基的改良品，适用于生长较快、附着性较差的细胞培养。在早期胚胎包括以后ES细胞的培养液中都常添加2-基乙醇(2-mercapto ethanol，2-ME)，可促进细胞生长，能使血清中含硫化合物还原成谷胱甘肽，对诱导细胞增殖，延缓细胞衰老发挥非特异性的激活作用，避免了过氧化物对细胞的损害。此外，2-ME还能促进分裂原的反应和DNA的合成，对在体外难以培养的细胞来说尤其重要。早期胚胎按分离ES细胞的传统方法是将胚胎从子宫中取出后在饲养层上培养至附植阶段，此时将透明带脱去胚胎贴于饲养层细胞之上，待早期胚胎内细胞团(inner cell mass，ICM)增殖到一定程度，在立体显微镜下用玻璃针剥离挑取ICM，然后，用消化液把ICM离散成小细胞团，中和后，接种于新鲜饲养层上，以后根据情况进行克隆传代或冷冻保存或其他细胞操作。所用饲养层一般为STO(一种成系的小鼠胎儿成纤维细胞)原代小鼠胚胎成纤维细胞(primary mouse embryonic fibroblasts，PMEF)，后者因其材料易得、价格低廉，且效果良好而被更广泛采用。除以上传统处理胚胎方式外，许多学者还尝试其他处理方式也取得一定的成绩，常见的有免疫外科法、热休克法等。前者方法是将完整囊胚用酸性台氏液处理，除去透明带用Hanks液冲洗后，将胚胎移入 ICR 小鼠脾细胞抗血清中作用一段时间后，移到含新鲜豚鼠血清的 Hanks液中，从而破坏了胚泡的饲养层，把剩下的ICM 进行离散操作即可获得ES细胞。后者是将体内发育至双细胞或桑葚胚阶段的胚胎从输卵管或子宫中冲洗出来后，在高温下处理一定时间，有实验显示以此能增加ES细胞的克隆率，原因是在胚胎分裂活跃期用热应激处理能阻滞胚胎分化，从而扩大了ES细胞分离的时间范围。同时研究还表明热休克蛋白25(HSP25)与胚胎分化有关，HSP25可作为胚胎分化的标记。