目前，胚胎干细胞的研究已经取得很大的进展，但是迄今为止仅从小鼠获得真正意义的胚胎干细胞，即具有参与生殖系传递能力的胚胎干细胞。这说明在其他动物及人类胚胎干细胞研究方面还存在未知的影响因素，笼统说来包括饲养层、培养基、添加物、胚胎日龄、遗传背景以及获取原始生殖细胞的时间等因素。

一、饲养层

        所谓饲养层(滋养层)就是指一些特定细胞(如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等易在体外培养的细胞)，经有丝分裂阻断剂(常用丝裂霉素)处理后所得到的细胞单层。它在ES细胞的常规分离培养中是最常用的生长增殖促进剂和分化抑制剂，目前，常用的饲养层细胞有STO、PMEF、HEF(同源胎儿成纤维细胞)、UE(子宫上皮细胞)、BRL(大鼠肝细胞)等。饲养层对胚胎干细胞分离克隆的影响，主要体现在饲养层种类、丝裂霉素处理饲养层的时间、饲养层细胞的代数和饲养层细胞的密度等。动物种类不同对饲养层种类的要求也不同，一般来说小鼠胚胎成纤维细胞所做的饲养层如 STO、PMEF等对各种动物都较适宜，但最可靠的方法还是根据动物种类筛选最佳饲养层为宜。饲养层的选择直接关系到胚胎干细胞分离克隆的效果。Suemof H等比较了STO和PMEF 做饲养层对小鼠ES细胞分离克隆的影响，发现PMEF比STO饲养层更适合用于小鼠ES细胞的培养，从STO饲养层培养的ICM细胞中分离的ES细胞存活率、嵌合力均不如PMEF饲养层，而且核型异常率比后者高。

        动物种类不同所需最适饲养层也不同，需经过筛选来确定最适宜该种动物ES分离克隆的饲养层。除饲养层细胞种类外，有丝分裂阻断剂(常用丝裂霉素)的处理时间，饲养层细胞的所处代数，以及饲养层细胞的密度等都直接影响着ES细胞分离克隆的效果。目前丝裂霉素处理时间在小鼠成纤维细胞上一般要求为:在37℃，5%CO₂饱和湿度的条件下处理24h,时间过短达不到预定目的，成纤维细胞不能被成功的抑制住;处理时间过长，则使细胞老化、活性下降、分泌因子的能力降低，从而直接影响到ES细胞增殖和分化的抑制。同时处理完毕后细胞的清洗工作也相当重要，一般要求用无钙镁PBS冲洗4~5遍，以确保丝裂霉素的彻底清除。此外，选为作饲养层的细胞代数和接种密度的选择也很重要，以小鼠成纤维细胞为例，选3~5代，密度为1x10⁶~1x10⁷/ml为宜，代数过低所含杂细胞太多，代数过高则细胞的活力降低。